生物节律相关基因BMAL1和CRY1在肝癌发生发展中的功能和机制探讨

摘要

从正常人全脑marathoncDNA中克隆到人生物节律基因BMALl和CRYl的开放读码框架(ORF)，经酶切和测序鉴定与GeneBank数据库中收录的序列基本一致。其中BMALl定位于染色体1lpl5，含有20个外显子和19个内含子；编码蛋白626aa,分子量为68kDa；蛋白序列与已知的ARNT和AHR高度同源，为含有bHLH-PAS结构的转录调控因子；在果蝇、爪蟾、小鼠、大鼠和人等生物中均有同源物表达。CRYl定位于12q23—24．1，含13个外显子和12个内含子；编码蛋白586aa,分子量66kDa；蛋白序列与果蝇photolyase同源，两种CRY蛋白结构上同源性高，都含有DNAphotolyase和FADDNAbinding结构域；从果蝇到小鼠和人都可以发现CRYl的同源物表达。 通过Northern杂交MTN多组织膜片显示，BMALl有3个转录本，分别为2．0kb、2．8kb和5．0kb,其在心、胎盘、肝、骨胳肌和肾中都有较高水平的表达；CRYl有1个约3．0kb的转录本，在各种正常人组织中都有表达。RT-PCR也可以从正常肝组织、胎盘、卵和脑中扩增出BMALl与CRYl基因片段。说明BMALl与CRYl可以在各种人正常组织中表达。通过RT-PCR在4种肝癌细胞，2种脑胶质瘤细胞，2种肺癌细胞，乳腺癌细胞，卵巢癌细胞，宫颈癌细胞，骨肉庙细胞等13种肿瘤细胞中检测到BMALl和CRYl的表达。说明这两种生物节律基因不仅在各种人正常组织中表达，同样在离体培养的肿瘤细胞中也可以表达。 为了检测BMALl与CRYl在肝癌与癌旁组织中的表达差异，分别使用了Northernblot、半定量RT-PCR和免疫组织化学方法分析。Northernblot结果显示，在8对肝癌与癌旁组织中,BMALl和CRYl均在87．5％(7／8)癌旁组织中有相对高的表达；反转录PCR检测另外8对肝癌与癌旁组织结果为，BMALl和CRYl在62．5％(5／8)的癌旁组织中有相对高的表达；免疫组化分析163对肝癌与癌旁组织中BMALl的表达在癌旁组织(53％)高于肝癌(23％)，而CRYl在185对样品中也于癌旁组织(29％)高于肝癌中(12％)。以上试验说明，BMALl和CRY1-基因在肝癌及对应的癌旁组织中都有表达，而且在同样的样品中呈现癌旁表达高于肝癌组织的趋势。 GFP亚细胞定位确定二者均定位于细胞核中，与以前在其它生物中细胞定位的结果一致，说明二者的生物作用主要发生在核内。将BMALl与CRYl均亚克隆到真核表达载体稳定转染SMMC-7721细胞，通过测定生长曲线和在软琼脂克隆数以及在裸小鼠体内形成的瘤重，检测体外与体内细胞增殖试验，均未见有生长速度上的明显差别。而初步检测5种生物节律相关基因(CLOCK，BMALl，WEEl，PER2和CRYl)在稳定过表达BMALl或CRYl的细胞中的表达水平虽有变化，但未显示有可见的规律。说明体外过表达一种生物节律基因对细胞增殖的影响并不明显。

目录

第一部分人生物节律相关基因BMAL1和CRY1的克隆与序列分析 前言

第一部分人生物节律相关基因BMAL1和CRY1的克隆与序列分析 材料和方法

第一部分人生物节律相关基因BMAL1和CRY1的克隆与序列分析 结果

第一部分人生物节律相关基因BMAL1和CRY1的克隆与序列分析 讨论

第一部分人生物节律相关基因BMAL1和CRY1的克隆与序列分析 小结

第二部分BMAL1和CRY1基因功能与肝癌关系的初步研究 前言

第二部分BMAL1和CRY1基因功能与肝癌关系的初步研究 材料和方法

第二部分BMAL1和CRY1基因功能与肝癌关系的初步研究 结果

第二部分BMAL1和CRY1基因功能与肝癌关系的初步研究 讨论

第二部分BMAL1和CRY1基因功能与肝癌关系的初步研究 小结

参考文献

综述 生物节律基因概述

致谢

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