PEDF基因修饰色素上皮细胞对脉络膜新生血管作用的体外研究

摘要

目的：分离、培养和纯化原代视网膜(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE)，比较RPE与IPE的生物学特性。分离和培养原代脉络膜毛细血管内皮细胞(CEC)，建立脉络膜新生血管体外模型。通过体外实验的方法研究色素上皮源性因子(PEDF)及PEDF基因修饰的色素上皮细胞对脉络膜新生血管的作用。材料和方法：采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE细胞，进行体外培养，密度梯度离心法纯化，免疫组化的方法进行鉴定。观察比较RPE、IPE细胞的超微结构、生长状况，RT-PCR方法检测与RPE功能密切相关的几种蛋白质mRNA的表达。采用磁分选技术分离培养原代的脉络膜毛细血管内皮细胞，用Ⅳ型胶原铺板，诱导细胞分化、连接形成血管样结构。用脂质体介导基因转染法将人PEDF基因导入体外培养的虹膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞，利用质粒包含的抗稻瘟菌素的耐药性基因筛选稳定表达PEDF的色素上皮细胞株。RT-PCR鉴定PEDF在细胞内的表达；ELISA方法检测细胞分泌PEDF的水平。采用CultureInsert共培养PEDF基因修饰的色素上皮细胞和CEC细胞，观察PEDF对有或无血管内皮生长因子(VEGF)刺激条件下CEC的增生、移行和血管样结构的形成的影响效应；ELISA方法检测共培养细胞上清液中VEGF浓度。结论：RPE、IPE细胞形态与体外培养的生物学特性类似，IPE细胞能够表达部分和RPE功能密切相关的蛋白。借助磁分选技术能够分离出高纯度的脉络膜毛细血管内皮细胞，在类似细胞外基质成分的环境下能够分化形成血管样结构。PEDF基因修饰的IPE和RPE细胞对共培养的CEC细胞增生、移行有抑制作用，对正常培养的CEC细胞的上述功能没有抑制作用。PEDF和转染后的色素上皮细胞能够抑制CEC在体外分化形成新生血管。

目录

论文说明：图表索引

前言

第一部分视网膜色素上皮和虹膜色素上皮细胞的比较研究

(一)原代视网膜色素上皮细胞和虹膜色素上皮细胞的培养和鉴定

(二)视网膜色素上皮细胞和虹膜色素上皮细胞的比较研究

第二部分脉络膜新生血管体外模型建立

第三部分转基因色素上皮细胞对CNV作用的体外研究

(一)脂质体介导PEDF基因转染色素上皮细胞

(二)PEDF和PEDF修饰的色素上皮细胞对CNV作用的研究

摘要

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

致谢

附录

主要试剂和设备

文献综述：色素上皮源性因子(PEDF)研究进展

发表论文及参加学术活动

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