新型抗凝、防栓剂——重组双功能水蛭素（r-RGD-Hirudin）的研制

摘要

天然水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂，从医用水蛭的唾液腺中提取而得。为65-66个氨基酸残基的无糖基化的单链多肽，分子量约7,000Da，N端为活性中心区，能插入凝血酶的活性中心，抑制凝血酶活性；N端区域所含3对二硫键对空间构象起稳定作用；C端含有较多的酸性氨基酸，能与凝血酶分子碱性氨基酸富集的区域特异性结合，与其强烈的抗凝活性也有重要关系。水蛭素对凝血酶有很高的亲和力，它与凝血酶形成摩尔比为1：1的非共价结合的可逆复合物，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，抑制纤维蛋白的凝固，同时它也能阻断凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板反应，所以极低浓度的水蛭素即可抑制凝血酶，显示抑制血液凝固等功效。基于水蛭素的这些特点，用它作为防治血栓的药物有诸多优点，(1)专一性强，直接特异性抑制凝血酶活性，不良反应少而轻；(2)分子量小，几乎没有抗原性；(3)小分子蛋白质，几乎没有毒性。 基于对天然水蛭素构效关系的深入研究，在保留天然水蛭素原有活性的基础上，将Arg-Gly-Asp(RGD)融合在水蛭素分子的合理部位，由此形成新型分子，然后构建了含RGD编码顺序的水蛭素衍生物cDNA克隆RGD-Hirudin-pPIC9K，表达质粒转化毕赤酵母后，经筛选获得快型高表达菌株，并建立工程菌株。发酵罐大量培养工程菌，经甲醇诱导后，从培养液上清纯化表达产物，并证明表达产物兼有抗凝血酶和抗血小板聚集的双重功能，我们将其命名为重组双功能水蛭素(r-RGD-Himdin)。 药效学研究证明，r-RGD-Himdin用于血管吻合术后抗凝、防栓治疗，疗效确切。治疗剂量比野生型水蛭素降低2-3倍，未见出血等不良反应，预计临床试用也会安全、有效。 利用超临界C02包衣技术，将聚乳酸等包衣材料均匀包覆在药物颗粒表面，形成卜RGD-Hirudin的口服制剂，能抵抗胃酸和消化酶对药物的降解作用，口服后6-8小时，药物通过结肠吸收。这种技术可用于其他蛋白质／多肽类药物的特殊制剂的研究。 一、基于蛋白质构效关系研究，设计和研制r-RGD-Himdin 经过计算机分子模拟，设计了新型RGD-Himdin分子。根据酵母偏爱密码子对天然水蛭素基因的核苷酸序列进行优化，并在合理位置融合了Arg-Gly-Asp（RGD)三肽编码序列，合成目的基因。将全合成的目的基因与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒，转化毕赤酵母GS115宿主菌，经G418筛选得到高表达的阳性克隆，PCR鉴定为甲醇利用快型(Mut+)。在摇瓶实现高效、稳定和分泌性表达r-RGD-Himdin；表达量达0．1g几。 分离、纯化表达产物，经核磁共振试验，结果显示与天然水蛭素相比，构成r-RGD-Himdin分子空间构象最重要的4个氨基酸，即Tyr3，His51，Phe56和Tyr64的芳环上的质子的化学位移几乎没有什么变化，说明r-RGD-Himdin的空间结构没有因为RGD三肽序列的引入而产生明显的变化。凝血酶滴定法测定r-RGD-Himdin的抗凝血酶比活性大于10,000ATU／mg，和wt-Himdin几乎没有差别；比浊法测定r-RGD-Himdin抗血小板聚集比活性，终浓度1.5μg／mL，血小板聚集抑制率为10-20％，说明r-RGD-Himdin具有抗血小板聚集的功能。 放射竞争抑制试验显示r-RGD-Himdin竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合，半数抑制浓度为0．4gmol／L；r-RGD-Himdin与血小板结合的亲和力比纤维蛋白原大37倍。利用流式细胞技术研究了r-RGD-Himdin与血小板膜GPIIb／IIIa的亲和力，与临床常用的抗GPIIb／IIIa药物一一硫酸氢氯吡格雷相比，r-RGD-Himdin对GPIIb／IIIa的半数抑制浓度为0．3gmol／L；以完全抑制血小板活性的药物终浓度相比，卜RGD-Himdin与血小板结合能力比硫酸氢氯吡格雷大500倍。。 二、卜RGD-Himdin的中试研究 在实验室初步表达试验及优化试验的基础上，采用30LNBS发酵罐(BioFlo4500)研究溶氧、接种密度、碳源、诱导时密度、诱导时间、甲醇的具体控制等发酵工艺的最适参数。 工程酵母菌(RGD-Himdin-GS115)经3天发酵，离心后取培养液上清，超滤浓缩，凝胶过滤层析，离子交换层析后，得到比活性为12,000ATU／mg的r-RGD-Himdin，回收率大于50％，产率大于1．0g/L纯化后的r-RGD-Himdin经过SDS-PAGE、LC／MS、等电聚焦电泳、Western-Blot和紫外吸收光谱等分析，其纯度达到97％以上，分子量为7,030Da、等电点为pH4．2左右，与野生型水蛭素相符，证明表达产物为水蛭素的衍生物，抗凝血酶活性测定和抗血小板聚集活性分析证明r-RGD-Himdin具有抑制凝血酶活性和抑制ADP诱导的血小板聚集双重功能。HPLC分析r．RGD-Hiredin纯品含2个主峰，进一步分析证明第一主峰是分子量为7,030Da，含量大于70％，含65个氨基酸残基的r-RGD-Himdin，第二主峰是分子量为7,180Da，含量小于30％，含66个氨基酸残基的卜RGD-Himdin，两者含量总和大于97％。分别测定两者的抗凝血酶比活性和抗血小板聚集比活性，几乎没有差别，说明两者都是r-RGD-Himdin。 纯化后样品含有磷酸盐、氯化钠、r-RGD-Himdin三种溶质，三种溶质的总含量为2-3％，以甘露醇为辅剂，制成静脉注射用粉针剂，冻干品色泽均匀，稳定性试验表明储存于4-8℃2年以上，活性无明显改变。 对中试产品的质量控制作研究，原液的质量控制和成品的质量控制，共24项指标均符合静脉注射用药的国家质量标准。 三、r-RGD-Himdin的药效学研究和安全性评价 建立了大鼠股动脉吻合术后抗凝、防栓治疗模型和兔颈总动脉吻合术后抗凝防栓治疗模型。大鼠腹腔注射卜RGD-HimdinO．1mg／kg、0．2mg／kg、0．5mg／kg。每日用药1次，连续3天，首次静脉注射，其后腹腔注射；家兔首次静脉注射r-RGD-Hirodin，以后皮下注射，剂量为0．2mg／kg、0．5mg／kg、1．Omg／kg，每日用药2次，连续3天。试验结果证明r-RGD-Himdin用于血管吻合术后抗凝治疗，疗效优于野生型水蛭素和肝素，降低血黏度，抗凝、防栓作用更强。临床应用剂量可望比野生型水蛭素降低2-3倍，有显著疗效，未见出血等不良反应。 免疫原性试验显示豚鼠腹腔注射r-RGD-Himdin3倍临床拟单次使用剂量，隔天注射，共3次，2周和3周后静脉注射6倍临床拟单次使用剂量的r-RGD-Hirudin，未见过敏性休克；致敏2周和3周，取血，ELISA测定抗卜RGD-Hirodin抗体滴度，几乎检测不到抗体。 四、r-RGD-Himdin的特殊制剂的研究 利用超临界C02流体包衣技术，以聚乳酸为包衣材料包覆r—RGD-Hiredin药物颗粒，制成口服制剂。口服后6．8小时，血液中出现药物浓度高峰，血浆部分凝血活酶时间延长2倍。

目录

中英文对照缩写表

摘要

前言

二、r-RGD-Hirudin的中试研究

三、r-RGD-Hirudin的药效学研究和安全性评价

四、r-RGD-Hirudin特殊制剂的研究

总结和展望

参考文献

综述水蛭素的研究进展及其在抗凝治疗中的应用

致谢

附录