荧光定量PCR检测嵌合率及微小残留病方法的建立及与复发关系的相关性研究

摘要

白血病(Leukemia)是在造血干/祖细胞水平转化的一类克隆性恶性血液病。在恶性肿瘤中，其死亡率在男女性分居第6位和第8位，而在青壮年人群中则是威胁生命安全的首要原因，因而越来越受到全世界人们的重视，成为当前研究的热点。白血病的治疗方法包括最基本的联合化疗及造血干细胞移植。目前联合化疗对初治白血病的临床缓解率可以达到80％-90％，造血干细胞移植的成功率也在不断提高。但是复发仍然是白血病治疗失败的主要原因。对于治疗失败的患者来说，复发的根源在于体内残留的白血病细胞，而对于移植的患者供体细胞嵌合率也与移植后的复发有着紧密的联系。 异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是多种血液系统疾病及自身免疫疾病的重要治疗手段，而移植成功与否与供体细胞在受者体内的植入方式一嵌合状态(chimerism)的形成和发展有关。广义的讲，任何非己成分与自身成分共存的现象，都是嵌合状态，但在移植耐受中，嵌合状态是指血细胞的嵌合。研究表明allo-HSCT后受者体内细胞的存在方式有以下几种。①完全嵌合状态(completechimerism，CC)即供者细胞完全植入，代替了受者细胞；②混合嵌合状态(mixedchimerism，Mc)即供受者细胞同时存在于受者体内；③完全受者型(recipientcomplete RC)即供者的细胞逐渐被排斥或者消失。几种嵌合状态中，多认为以CC为好，MC与临床复发的关系尚存在争议，一般认为移植后受者细胞比例逐渐增加或CC后再重新检测到受者细胞成分可能预示疾病晚期复发。因此嵌合体分析已成为一种证实植入的常规方法。目前检测嵌合状态的主要方法均是利用了DNA的多态性，包括①可变数目串联重复序列(variable numbers of tardemrepeats，VNTR)又称小卫星(minisatellite)。②短串联重复序列(short tandemrepeats，STR)又称微卫星(microsatellite)。这种方法是目前最常用的方法且具有很高的准确性。③限制性片段长度多态性(RELP)。④缺失或插入双等位基因多态性(Indels)和单链核苷酸多态性(SNPs)。Indels和SNP的多态性分析均可以用荧光定量方法进行，因此利用Indels和SNP的多态性可以把荧光定量PCR技术引入嵌合体的检测，以提高灵敏度和准确度。 慢性粒细胞白血病，是伴有获得性染色异常的多能干细胞水平上的恶性变引起的一种恶性血液病。Ph染色体是慢粒的特异性染色体畸变，95％以上的本病患者存在t(9；22)(q34；q11)，形成bcr/abl融合基因，编码产生P210蛋白，P210蛋白能够增强酪氨酸激酶的活性，导致粒细胞转化和过度增殖，从而导致慢粒。格列卫是一种专门针对Ph染色体阳性白血病的特异性药物，主要功能是抑制酪氨酸激酶的活性，已用于慢粒的临床治疗。根据上述原理，bcr/abl融合基因的表达变化情况既可以反映患者体内残留的白血病细胞水平，同时可反映临床治疗比如格列卫的效果。目前尚未见格列卫治疗期间bcr/abl融合基因的表达变化情况的动态观察报道。 本文的实验目的包括: ①建立造血干细胞移植后荧光定量PCR检测嵌合状态的相对定量方法，以及RQ-RT-F)CR监测残留白血病的绝对定量方法。②利用实时荧光定量PCR技术对移植后供体细胞嵌合率以及慢粒应用格列卫治疗前后的BCR/ABL融合基因的表达情况进行了检测，并分析了其相关性，为临床监测白血病的复发提供理论依据。 第一部分：荧光定量PCR检测移植后嵌合体方法的建立及与复发的相关性研究 近来在人类基因组中，许多具有缺失或插入多态性的双等位基因被发现。利用这种多态性作为区别不同个体的基因marker，我们建立了检测移植后嵌合率的荧光定量PCR方法。首先在基因库中选择了具有缺失或插入多态性的四条基因，SRY、Xq28、GSTMl、GSTT1。其中SRY仅在男性体内存在，Xq28、GSq、M1、GSTT1的缺失率文献报道分别为(30％、47％、17％)。分别在四条基因的缺失序列上设计引物及探针，同时也为管家基因β-globin设计好引物及探针。选取临床患者外周血标本，常规方法提取DNA，-20℃保存备用。随机选择备用DNA标本，分别对SRY、Xq28、GSTM1、GSTT1及管家基因β-globin进行定性PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化、回收目的产物，连接T载体，转化入大肠杆菌，LB培养基，37C°，150rpm震荡14-16小时，提取质粒测浓度后备用。质粒同时送三博公司测序。将不同基因的质粒按2倍倍比稀释后进行荧光定量检测，作出各基因的标准曲线，并得到各基因的扩增效率E。文中17例标本为供受者性别不符，用SRY基因进行检测。14例供受者性别相符标本在预试验中已验证可用Xq28、GSTM1、GSTT1三种基因对供受者进行区分。以移植前目的基因与管家基因的比值为原始参照，移植后不同时间点的相应值与之进行比较得到数据。并与STR方法的结果进行了比较。结果证明该方法敏感性可达10<'-4>-10<'-5>,结果与STR相比基本一致，但该方法更准确、快速、敏感。移植后复发患者的嵌合率在不同时间段的检测结果具有明显的下降趋势，差异具有显著性(P<0.05)。这种趋势在外周血与骨髓中是一致的，但骨髓较外周血提前，因此嵌合率的下降可预示复发。复发多发生在移植后60天左右。 第二部分：荧光定量PCR检测BCR/ABL融合基因方法的建立及该融合基因mRNA表达水平的变化与CML患者格列卫治疗效果的相关性研究 Ph染色体是慢粒的特征性染色体畸变，9号染色体和22号染色体长臂的异位导致位于9号染色体上的BCR基因与位于22号染色体上的ABL基因融合形成BCR/ABL融合基因。这种融合基因共有三种融合类型，b2a2，b3a2，ela2，其中前两种类型可覆盖95％的慢性粒细胞白血病患者，不仅可以用来辅助临床诊断，还可以用来监测患者体内的残留白血病细胞，从而预测复发。本章建立一种可以特异的对b2a2，b3a2两种类型融合基因进行检测的实时荧光定量PCR方法。选择K562细胞系，常规方法提取RNA逆转录为cDNA，在两种类型的融合基因的共有区域设立上下游引物和探针，进行BCR/ABL以及管家基因GADPH的定性PCR，将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，之后将目的条带切下利用试剂盒将目的基因序列纯化回收。将BCR/ABL序列和GADPH与PGM-T载体连接形成质粒转化入大肠杆菌，LB培养基，37℃，150rpm震荡14-16小时，提取质粒后测浓度，并测量出拷贝数倍比稀释为10<'7>，10<'6>，10<'5>，10<'4>，10<'3>，10<'2>，10等不同梯度待用。选择临床确诊的慢性粒细胞白血病应用格列卫治疗的患者，留取治疗前及治疗后7天、14天、21天、1个月、2个月的外周血，Ficol分离单个核细胞，提取RNA，逆转录为cDNA备用。选取10<'6>，10<'5>，10<'4>，10<'3>，10<'2>，的BCR/ABL和GADPH质粒进行荧光定量PCR作出标准曲线，利用管家基因作为外参照，测出不同时期BCR/ABL融合基因表达水平。 结果：格列卫治疗前后不同时间点，BCR/ABL融合基因的表达水平呈明显下降趋势，治疗前后两组数据进行t检验，结果有显著性(P<0.05)证明格列卫对BCR/ABL融合基因的表达具有明显的抑制作用，疗效显著。将不同时间点测量结果进行方差分析，结果有显著性。(P<0.05)，表明BCR/ABL的表达水平随格列卫治疗时间的进展而逐渐下降。

目录

论文说明:英文缩写

声明

前言

第一章 实时荧光定量检测造血干细胞移植后供者细胞植入率

一、材料与方法

二、实验结果

1.SRY基因的扩增及质粒标准品的构建

2.Xq28基因的扩增及质粒标准品的构建

3.GSTM1基因的扩增及质粒标准品的构建

4.GSTT1基因的扩增及质粒标准品的构建

5.β-blobin管家基因的扩增及质粒标准品的构建

6.实时荧光定量PCR

7.临床移植标本检测结果

三、讨论

第二章： 实时荧光PCR法检测慢粒格列卫治疗后BCR/ABL融合基因表达水平

一、材料和方法

二、实验结果

三讨论

参考文献

总结

致谢

综述 残留白血病检测基因标志的研究进展