TGF-β1对Smad7基因转染大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞表型的影响及其相关机制的研究

摘要

近年来随着人均寿命的延长、肿瘤放化疗的应用，肺间质弥漫性纤维化的发病率逐年上升。尽管目前有大量关于肺纤维化的相关研究报道，但其确切发病机制仍未完全阐明，且临床上无有效的防治方法。 以往国内外学者，包括本课题组的研究均发现肺纤维化时其增生的间质细胞在免疫标记、光镜和电镜形态学上具有明显的异质性。但限于实验条件和理论准备的不足，一直认为肺纤维化时增生的间质细胞主要是成肌纤维细胞(Myofibroblast，MFb)，而MFb来源于肺内固有的间充质细胞。2000年后有学者提出器官纤维化病灶内MFb多源性学说，在肺纤维化有报道除了肺内固有的间充质细胞外，MFb还可能来自外周血(骨髓源性)；新近有文献报道肺纤维化病灶内肺泡II型上皮细胞可能通过上皮细胞向间质细胞转变 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)也可以作为MFb的部分来源。转化生长因子-β1 (transforming growth factorTGF-β1) 在EMT转化过程中起着重要作用。近年的研究发现Smad(Sma/MothersAgainst Decapentaplegic)蛋白是TGF-β1细胞内信号转导过程中极其重要的介导分子。在TGF-β1与其靶细胞膜上的受体(Tβ-R)结合后，可激活受体性Smad2和Smad3，进而与共同通路性Smad4形成三聚体转位到核内，并在核内相关因子的共同作用下，参与上调一些与EMT相关基因的表达。在此过程中，有研究表明，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)可能通过促生长、抑调亡作用协同TGF-β1诱导肾小管上皮EMT的完全发生。 本课题首先在体外观察TGF-β1对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN表型改变的影响及相关机制；接下来采用体外稳定细胞转基因技术，观察Smad7基因转染大鼠RLE-6TN细胞后TGF-β1对其表型改变的影响：观察TGF-β1及EGF联用对RLE-6TN细胞表型、功能改变的影响及相关机制；以明确肺纤维化时肺内成肌纤维细胞可能存在的上皮源性，探索TGF-β1/Smad信号通路在肺纤维化发生中的作用，从而进一步阐明肺纤维化的发病机制，为改善肺纤维化临床防治打好基础准备。 第一部分 TGF-β1 诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变 目的：检测TGF-β1能否在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)及其相关的信号转导机制。 方法：在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(REE-6TN)中加入TGF-β1(3ng/ml)后，于不同时间段收取细胞，分别采用Real-time PCR和Western Blot(W．B)检测上皮细胞特异性标志物(E-cad，CK19)及间质细胞特异性标志物 (α-SMA、 FN和Vimentin)表达的改变；W．B检测TGF-β1对RLE-6TN细胞 p-SAPK/JNK、p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-Akt及p-Smad2蛋白表达的影响；间接细胞免疫荧光法检测α-SMA的表达；TGF-β1诱导的RLE-6TN细胞形态学的改变采用倒置相差显微镜观察；超微结构的改变采用透射电子显微镜观察；其体外迁移能力的改变采用Transwell小室检测。 结果：加入TGF-β1到RLE-6TN细胞后，其总的间质细胞标志物mRNA的表达是上调的，其中Vimentin的表达于1h、3h及24h上调，分别为对照组的4.03倍(P<0.01)、3.37倍(P<0.05)及2.43倍；α-SMA mRNA的表达于TGF-β1作用后各时间点均上调，而以1h及24h为著，分别为对照组的7.39倍(P<0.01)及8.37倍(P<0.01)；FN mRNA的表达于1h、3h及6h上调，而以3h表达最高，为对照组的2.43倍(P<0.01)；在TGF-β1作用下，RLE-6TN细胞总的上皮细胞标志物的表达是下调的，其中E-cad mRNA的表达从3h起开始下调，而以6h及12h为著，均为对照组的66％(P<0.05)；CK19 mRNA表达从1h起下调，而以3h及24h下调最明显，分别为对照组的46％(P<0.01)及12％(P<0.01)。另外，在TGF-β1作用下，RLE-6TN细胞的自分泌性TGF-β1mRNA的表达水平上调，而以1h、3h及24h为著，分别为对照组的4.38倍(P<0.01)、4．34倍(P<0.01)及3.23倍；RLE-6TN细胞EGFR mRNA的表达于1h、3h、6h及24h上调，而以1h最明显，为对照组的2.92倍(P<0.01)；加入TGF-β1到RLE-6TN细胞后，其p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-Akt及p-Smad2等蛋白表达上调，p-SAPK/JNK表达无明显改变；形态学上，TGF-β1能诱导RLE-6TN细胞离散成单个，形态成梭形、纺锤形；超微结构上，TGF-β1诱导RLE-6TN细胞特有的嗜锇性板层小体发生变性、肿胀并随TGF-β1作用时间延长最终完全消失；在TGF-β1作用下，部分RLE-6TN细胞表达α-SMA且迁移到微孔滤膜上的细胞数明显增加(P<0.01)。 小结：1、TGF-β1能在体外诱导RLE-6TN细胞 EMT；2、TGF-β1诱导的RLE-6TN细胞EMT是包括Smad及EGFR下游多条信号转导通路激活后综合作用的结果。 第二部分过表达Smad7对TGF-β1诱导的RLE-6TN表型改变的影响 目的：检测过表达Smad7蛋白对TGF-β1诱导的RLE-6TN表型改变的影响及相关信号转导机制。 方法：pcDNA3.0-mSmad7质粒纯化，酶切鉴定后采用脂质体介导法将其转染到大鼠RLE-6TN细胞，用G418对克隆进行筛选，RT-PCR、W.B和免疫荧光法对阳性克隆进行鉴定；RLE-6TN细胞Smad7基因转染前后上皮及间质细胞标记物蛋白表达采用W.B检测；在体外培养的阳性克隆细胞中加入TGF-β1后，于不同时间段收取细胞，分别采用Real-time PCR和W.B检测其上皮细胞标志物(E-cadh和CK19)、间质细胞标志物(FN、α-SMA及Vimentin)mRNA和蛋白表达的影响；间接细胞免疫荧光法检测α-SMA的表达；相差显微镜观察TGF-β1对其形态改变的影响，其体外迁移能力的改变采用Transwell小室检测。RLE-6TN细胞Smad7基因转染前后Smad信号通路相关蛋白表达变化采用W.B检测。 小结：1、经脂质体介导法将Smad7基因成功转染大鼠RLE-6TN细胞，并获得其阳性克隆(STl和ST6)；2、Smad7转染能在体外部分阻止TGF-β1诱导RLE-6TN细胞EMT的发生。 第三部分 TGF-β1与EGF对RLE-6TN细胞表型、功能的影响目的：探讨TGF-β1与EGF对体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)表型、功能的影响及可能作用的机制。 方法：RLE-6TN细胞生长至亚融合状态时，加入0.5％DMEM/F12培液同步化24h，然后将细胞分为4组：正常RLE-6TN组、TGF-β1组、EGF组、TGF-β1+EGF组。采用免疫荧光法检测其α-SMA的表达；W.B检测上皮细胞标记物E-cad、CK19及间质细胞标记物α-SMA、FN及Vimentin的表达：采用流式细胞术检测其凋亡的影响；W.B检测CD147、MMP2、MT1-MMP的表达。同步化24h的细胞分为3组：正常RLE-6TN组、TGF-β1组、EGF组。采用W.B分别检测MAPKs (包括ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK)、Akt及p-Smad2蛋白的表达。 小结：1、在体外培养的RLE-6TN细胞体系中，单用EGF不能诱导其发生EMT，TGF-β1及EGF合用无明显协同诱导EMT发生效应，却能协同诱导其发生凋亡； 2、FGF-β1诱导RLE-6TN EMT时，主要通过EGFR及下游信号分子参与诱导其MMPs表达。 结论 1、TGF-β1能在体外诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮RLE-6TN细胞向间质细胞转变； 2、TGF-β1诱导的上述EMT转变是包括Smad及EGFR下游多条信号转导通路激活后综合作用的结果； 3、经脂质体介导法将Smad7基因成功转染大鼠RLE-6TN细胞，并获得其阳性克隆(ST1和ST6)； 4、Smad7转染能在体外部分阻止TGF-β1诱导RLE-6TN细胞EMT的发生； 5、在体外培养的RLE-6TN细胞体系中，单用EGF不能诱导其发生EMT，TGF-β1及EGF合用无明显协同诱导EMT发生效应，却能协同诱导其发生凋亡； 6、TGF-β1诱导RLE-6TN EMT 时，主要通过EGFR 及下游信号分子参与诱导其MMPs表达。

目录

论文说明：英文缩略语注释

声明

前言

第一部分TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分过表达Smad7蛋白对TGF-β1诱导的RLE-6TN表型改变的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分TGF-β1与EGF对RLE-6TN细胞表型、功能的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

附录

致谢