内质网应激通路在高甘油三酯血症合并急性胰腺炎大鼠发病中的作用

摘要

高甘油三酯血症是急性胰腺炎的发病原因之一，但目前对其发病机制仍未完全明确。本实验通过体内试验和体外试验，分别观察：胰腺腺泡细胞在游离脂肪酸棕榈酸存在的情况下对细胞的损伤、内质网应激通路在细胞损伤中的作用及其产生的机制；通过高脂饮食诱导建立高脂(以血甘油三酯升高为主)大鼠动物模型，雨蛙肽诱发急性胰腺炎，研究内质网应激通路在发病中的作用。从而阐明内质网应激在高甘油三酯血症合并急性胰腺炎大鼠发病中的作用。 研究方法 一、体外试验部分： 1、胶原酶法分离大鼠的胰腺腺泡细胞，给予八肽胆囊收缩素(cholecystokinin-octopeptide，CCK-8)刺激胰腺腺泡细胞，测定细胞的淀粉酶释放比例，观察胰腺腺泡细胞的外分泌功能。 2、胶原酶法分离大鼠的胰腺腺泡细胞，分别与0.05mmol/L、0.1mmol/L 的棕榈酸共同培育1、2、3小时后，再给予CCK-8刺激胰腺腺泡细胞半小时，测定细胞淀粉酶释放比例，观察胰腺腺泡细胞在棕榈酸存在的情况下，细胞外分泌功能的改变情况。 3、透射电镜观察在棕榈酸存在下，胰腺腺泡细胞的凋亡情况。 4、半定量RT-PCR检测GRP78/Bi p、XBP-1、GADD153/CHOP、caspase-12的mRNA表达情况。 5、用特异性钙离子荧光探针(Fluo-3-AM)染色，在激光共聚焦扫描显微镜下测定胰腺腺泡细胞与0.05mmol/L、0.1mmol/L棕榈酸共同培育2、3小时后，在给予100pmol/L的CCK-8刺激下，测定细胞内钙离子的荧光强度，间接反映细胞内钙离子浓度的变化。 二、体内实验部分： 1、以高脂饮食喂养断奶一周的SD雄性大鼠8周，测定血清甘油三酯(triglyceride，TG)、胆固醇(cholesterol，TC)，建立高脂血症(以血清甘油三酯为主)动物模型。 2、4只高脂SD大鼠和24只正常大鼠分别随机分成4组：正常饮食组(n=6)、正常饮食+雨蛙肽组(n=18)、高脂饮食组(n=6)、高脂饮食+雨蛙肽组(n=18)。大鼠急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)诱导方法：腹腔注射雨蛙肽40 μg/Kg qh×2 次，分别于造模后9、12、24小时处死动物。观察胰腺组织病理学改变和血清淀粉酶活性，以确定高甘油三酯血症是否加重大鼠急性胰腺炎程度。 3、透射电镜下观察胰腺组织内胰腺腺泡细胞内的内质网形态的改变，用脱氧核糖末端转移酶介导的生物素缺口末端标记法(TUNEL)法检测胰腺腺泡细胞的凋亡。 4、半定量RT-PCR检测内质网应激的相关基因 GRP78/Bip (glucoseregulated protein)、GADD153/CHOP(C/EBP-homolo-gous protein,or growtharrest and DNA-damage-inducible gene 153)、XBP-1 (X box binding protein)分裂、caspase-12的mRNA表达情况；免疫组织化学染色检测GRP78/Bip蛋白的表达；Western blot检测GRP78/Bip、剪切的caspase-12蛋白的表达。 研究结果 1、体外成功分离胰腺腺泡细胞，分别与0.05mmol/L、0.1mmol/L的棕榈酸共同培育一定的时间，当给予100pmol/L的CCK-8刺激后，细胞的淀粉酶释放率随着培育时间和棕榈酸浓度的增加而增加，而且明显高于未加棕榈酸的细胞组(P<0.05)；当细胞与0.1mmol/L棕榈酸共同培育3小时后，再给予100pmol/L的CCK-8刺激后，可以检测到GRP78/Bip、GADD153/CHOP、分裂的XBP-1和caspase-12的mRNA表达。透射电镜下观察到相应的胰腺腺泡细胞出现凋亡。 2、体外分离的胰腺腺泡细胞，当与0.1mmol/L棕榈酸共同培育2小时，再给予100pmol/L的CCK-8刺激后发现，细胞内钙的荧光强度维持的高水平，较未加棕榈酸的细胞组明显增加(P<0.05)；而细胞与0.1mmol/L棕榈酸共同培育3小时后再给予100pmol/L CCK-8 刺激，细胞内钙的荧光强度的峰值和维持的高水平较未加棕榈酸的细胞组明显增加(P<0.05)： 3、高脂饮食8周后大鼠的血清甘油三酯和总胆固醇较正常饮食组明显升高(p<0.05)。雨蛙肽诱发急性胰腺炎后，高脂饮食大鼠的淀粉酶和胰腺的病理变化均较正常饮食组明显(p<0.05)，尤其在造模后9小时。 4、高甘油三酯血症大鼠合并急性胰腺炎后，胰腺组织内 GRP78/Bip、GADD153/CHOP、caspase-12 的mR/NA 表达较正常饮食合并急性胰腺炎大鼠明显增加(p<0.05)，XBP-1的mRNA出现基因的剪切；GRP78/Bip、剪接的caspase-12 蛋白出现阳性表达；透射电镜下高脂饮食合并急性胰腺炎大鼠的胰腺腺泡细胞内的内质网出现极度扩张、变形；TYBEL法显示高脂饮食合并急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞的凋亡指数较正常饮食合并急性胰腺炎大鼠有显著增加(p<0.05)。 主要结论及意义： 1、当棕榈酸与大鼠胰腺腺泡细胞共同培育后，细胞对CCK-8刺激所引起的外分泌功能明显增强，同时，大鼠胰腺腺泡细胞内钙离子浓度在一定时间内维持了较高的水平，并出现了内质网应激现象和细胞的相关凋亡。提示，高甘油三酯血症可能通过其分解产物游离脂肪酸增高大鼠胰腺腺泡细胞对CCK-8的敏感性，升高细胞内钙离子的浓度诱发内质网应激，从而引起细胞凋亡，加重胰腺腺泡细胞损伤。 2、高脂饮食8周后成功建立高甘油三酯血症大鼠模型，大鼠血清甘油三酯和总胆固醇水平明显升高(以甘油三酯升高为主)，雨蛙肽诱导发生急性胰腺炎后证实了高甘油三酯血症能够加重急性胰腺炎；当高甘油三酯血症合并急性胰腺炎时，大鼠胰腺腺泡细胞的凋亡增加，同时，胰腺组织内出现了内质网应激现象。

目录

声明

前 言

第一部分棕榈酸对大鼠胰腺腺泡细胞的损伤及内质网应激通路的作用

引言

材料和方法

结果

讨论

第二部分内质网应激通路在高甘油三酯血症合并急性胰腺炎大鼠发病中的作用

引言

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢