喜树中植物防御相关基因的克隆分析及对喜树碱含量的影响

摘要

植物次生代谢产物具有多种重要的生物学功能，在工农业生产和人们日常生活中具有广阔的应用前景。生物碱组成了植物最大的一类天然次生代谢产物，提供了许多具有药用活性的化合物。喜树碱和喜树碱衍生物属于单萜类吲哚生物碱，具有显著的抗癌生物活性。喜树碱是喜树中含有的一种生物碱，在植物防御反应中起着一定的作用。茉莉酸和甲基茉莉酸等茉莉酸类化合物，作为一种信号分子，在植物面对来自生物和非生物胁迫时，可以通过应激反应改变许多基因的表达。根据喜树自身的一些生理现象和喜树碱在其中可能参与的一些特殊作用，我们主要从喜树中克隆了茉莉酸合成途径的关键酶丙二烯氧化物环化酶(alleneoxide cyclase，AOC)基因(命名为CaAOC)并考察了其对喜树碱含量的影响，同时还进行了其他方面的相关研究。 1) 喜树和喜树细胞中生物碱含量研究为了便于生产研究，考察了来自喜树的不同组织(包括根、茎、叶、花苞、盛开的花、残花和种子)中的喜树碱(CPT)和 10-羟基喜树碱(10-HCPT)的含量。幼嫩的花苞中生物碱的含量最高，其中CPT是2.46mg/g DW，10-HCPT 是1.41mg/g DW。愈伤被作为这些药用化合物潜在的生产来源，也被用于考察。发现喜树细胞生长率与在不同生长时期CPT和10-HCPT的含量之间并没有表现出相关性。并进一步研究了在各种不同处理(伤、甲基茉莉酸、脱落酸、水杨酸和双氧水1等条件下喜树细胞中生物碱含量的变化。其中，紫外线照射这种伤害产生了最大的效应，相对对照CPT含量提高了11倍，而水杨酸则诱导10-HCPT提高了25倍。这个发现将有助于促进这两种药用化合物的生产。出乎意料的是，我们还发现甲基茉莉酸对喜树细胞中生物碱的合成有一定的抑制作用。这与长春花中萜类吲哚生物碱长春碱的研究结果相反。在这个方面我们还需进行更深入的研究。 2) 喜树中丙二烯氧化物环化酶基因的克隆和分析丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase，AOC，EC 5.3.99.6)是茉莉酸和甲基茉莉酸合成途径的一个关键酶。我们成功的从中国特有的药用植物－喜树中克隆了丙二烯氧化物环化酶基因CaAOC(Database Accession No．AY863428)。CaAOC在氨基酸水平与其他植物的 AOCs 具有显著的相似性。基因组全长和cDNA全长比较发现基因组DNA中存在两个内含子，一个是89bp，另一个是240bp。Southern杂交确定CaAOC属于多基因家族，实时荧光定量PCR的分析结果显示CaAOC在各种组织中属于组成型表达，在叶中表达水平最高。不同的信号分子(甲基茉莉酸、脱落酸、水杨酸和双氧水)诱导结果显示这些因素对CaAOC表达的影响有很大差异。重金属离子(铜离子)显著地增强CaAOC的表达，而伤(UV-B)并没有这么大的效果。 3) CaAOC基因在大肠杆菌和烟草中的耐盐和抗冻功能验证通过实时荧光定量PCR分析来自喜树AOC基因(CaAOC，Database AccessionNo．AY863428)的mRNA表达。它能够被120mM NaCl和4℃低温条件诱导表达。因此，CaAOC被转入大肠杆菌和烟草中进一步验证其在耐盐和抗冻过程中的功能。把去除了5’端叶绿体导肽的CaAOC基因的编码框，通过pET30载体在大肠杆菌菌株BL21DE3(pLysS)中表达，其阳性菌株可以在添加400mM NaCl的2YT培养基上生长。而原始菌株和带有空载体的菌株均不能生长。阳性转基因烟草在200mM NaCl的盐压力条件下，叶片中叶绿素含量均要高于非转基因植株。因此，CaAOC可能是通过基因工程来提高植物的盐耐受能力的潜在靶点。而通过考察离子释放程度发现转基因烟草叶片在低温条件下离子释放程度均要比非转基因烟草低。说明转基因烟草在低温条件下受伤害程度较小，对低温也具有一定的耐受性。 4) CaAOC基因遗传转化喜树及对喜树碱含量的影响通过农杆菌介导，把CaAOC基因转入喜树，并获得转基因喜树愈伤。RT-PCR结果显示在转基因喜树愈伤中CaAOC基因的表达量明显高于非转基因喜树愈伤。经过甲基茉莉酸诱导后，转基因喜树愈伤和非转基因喜树愈伤中CaAOC基因的表达量都有提高，而转基因的仍然高于非转基因。通过HPLC测定喜树愈伤中喜树碱含量，转基因喜树愈伤中喜树碱含量均高于非转基因喜树愈伤。其中转基因喜树愈伤中喜树碱含量最高可达3.9310 mg/g DW，最低达到1.0028 mg/gDW。而非转基因喜树愈伤中几乎检测不到喜树碱含量。经过甲基茉莉酸诱导后，转基因和非转基因喜树愈伤中喜树碱含量均较大幅度下降。但转基因喜树愈伤中喜树碱含量仍要高于非转基因喜树愈伤。这说明CaAOC基因转入喜树后，可能促进了下游茉莉酸的积累，茉莉酸可调控次生代谢产物途径很多基因的表达，从而提高了喜树碱含量，而外源施加的茉莉酸与内源的茉莉酸对喜树中次生代谢产物的诱导调控机制可能有所不同。 5) 喜树细胞色素P450基因CaSS的克隆和分析在高等植物中，P450参与了很多重要的次生代谢产物的合成。我们用RACE-PCR的方法首次从喜树中克隆了一个新型的茎特异表达的细胞色素P450基因CaSStfDatabase Accession No．AY466856)。cDNA全长是1735bp，开放阅读框fORF)是1530bp，编码509个氨基酸。通过生物信息学分析，CASS包含一个血红素结合区PFGXGRRXCX，并且与其他植物的细胞色素P450单加氧酶和羟化酶具有很高的同源性。Southern杂交确定CaSS是个单拷贝基因，Northern杂交分析CaSS在根、茎、叶和花中的表达，发现它只在茎中特异表达。我们的结果暗示CaSS可能参与苯基丙酸类合成途径(phenylpropanoid pathway)，为后面的研究工作打下基础。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前言

文献综述 喜树碱的代谢工程

第一章喜树和喜树细胞中生物碱含量研究

1.材料与方法

1.1植物材料与处理方法

1.2.喜树碱和羟基喜树碱含量测定

2.结果与讨论

2.1喜树中不同组织部位生物碱含量

2.2喜树细胞生长曲线和生物碱含量

2.3在各种不同处理下喜树细胞中生物碱含量

3.小结

第二章喜树茉莉酸途径关键酶基因的克隆和功能研究

前言

1.材料与方法

1.1植物材料、种植和处理方法

1.2菌株和载体

1.3试剂(盒)、酶及引物

1.4仪器和设备

1.5自配的其他试剂

1.6植物RNA的抽提及RNA质量检测

1.7采用CTAB法提取植物总DNA

1.8 DNA片段的回收、连接、克隆和测序

1.9 CaAOC目的基因克隆

1.10 CaAOC基因原核表达载体的构建及功能验证

1.11 CaAOC基因植物表达载体构建及遗传转化研究

2.结果和讨论

2.1 CaAOC全长cDNA及基因组的克隆和性质分析

2.2 CaAOC的生物信息学分析

2.3 CaAOC的Southern blotting分析

2.4 CaAOC在不同组织中的表达分析

2.5喜树细胞不同生长时期CaAOC的表达分析

2.6 CaAOC在不同诱导处理下的表达分析

2.7 CaAOC在高盐和低温处理下的表达分析

2.8原核表达载体的构建及分析

2.9目的蛋白的诱导表达结果和耐盐实验

2.10植物表达载体pCAMBIA1304+CaAOC的构建及分析

2.11转基因烟草的PCR和RT-PCR检测

2.12转基因烟草的耐盐实验分析

2.13转基因烟草叶片在低温下的耐受分析

2.14转基因烟草叶片中尼古丁含量分析

2.14农杆菌介导p1304+CaAOC遗传转化喜树

2.15转基因喜树愈伤的PCR和RT-PCR检测

2.16转基因喜树愈伤中喜树碱含量测定

3.小结

第三章喜树细胞色素P450基因CaSS的克隆和分析

1.材料与方法

1.1植物材料

1.2菌株和载体

1.3试剂(盒)、酶及引物

1.4植物RNA的抽提及RNA质量检测

1.5采用CTAB法提取植物总DNA

1.6 DNA片段的回收、连接、克隆和测序

1.7 CaAOC目的基因克隆

2.结果与讨论

2.1喜树中一个细胞色素P450基因CaSS的克隆分析

2.2 CaSS全长cDNA的克隆和性质分析

2.3 CASS的生物信息学分析

2.4 CaSS的Southern blotting分析

2.5 CaSS的组织特异性表达分析

3.小结

参考文献

博士期间参与的其他工作

SCI论文列表

致谢