E-钙粘蛋白不同位点N-糖基化对钙离子依赖细胞粘附及细胞周期进程的影响及分子机制研究

摘要

E-钙粘蛋白(E-cadherin)是主要分布于上皮细胞表面的I型跨膜糖蛋白，它不仅参与形成细胞间粘附连接(adherens junctions，AJs)、维持细胞极性和组织完整性，更重要的是它将细胞外信息传导入细胞内，介导细胞间的信息传递。E-钙粘蛋白能有效地抑制肿瘤细胞的增殖和转移，大量文献证实，许多恶性肿瘤的发生都伴有E-钙粘蛋白表达降低或功能缺失，因此E-钙粘蛋白被认为是一种重要的肿瘤抑制分子。 E-钙粘蛋白主要由胞外、跨膜及胞内肽段三部分组成。由人E-钙粘蛋白氨基酸序列推测(Gene Bank Accession No．L08599)，E-钙粘蛋白胞外肽段存在四个潜在的N-糖基化位点(N-X-S/T)，分别位于Asn 554、Asn 566、Asn 618及Asn 633(N554、N566、N618及N633)。虽然E-钙粘蛋白在介导钙离子依赖的细胞间粘附、抑制肿瘤发展方面具有重要的生物学功能，但是至今我们对其N-糖基化结构及功能的了解并不深入。 为了深入阐明E-钙粘蛋白N-糖基化的结构及功能，实验室前期，分别或联合地将这四个潜在N-糖基化位点的一致性序列(NXS/T)中的天冬酰胺突变为谷氨酰胺，构建了一系列缺失E-钙粘蛋白不同位点N-糖基化的突变E-钙粘蛋白真核基因表达质粒，并将这些质粒转染入本身不表达E-钙粘蛋白的高侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-435中，筛选后获得八株稳定表达细胞株。前期实验还发现，N633位点的N-糖基化似乎对于E-钙粘蛋白的稳定表达至关重要，去除这一位点的N-糖基化，E-钙粘蛋白在蛋白水平不能够表达。 如前所述，人E-钙粘蛋白胞外肽段存在四个潜在的N-糖基化位点，由于糖蛋白并非每个潜在N-糖基化位点都一定发生N-糖基化修饰， 本文的第一部分首先鉴定E-钙粘蛋白四个潜在N-糖基化位点是否存在N-糖基化，并应用质谱技术及糖苷酶酶切的方法初步了解N-糖链的结构。研究发现，E-钙粘蛋白四个潜在的N-糖基化位点都存在N-糖基化修饰，而且这四个位点的N-糖链可能都是复杂型N-糖链。 有文献报道，N-糖基化的异常修饰可能影响钙粘蛋白介导的细胞粘附。高尔基体内的糖基转移酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT-V)过表达，催化N-钙粘蛋白使其β1-6分支的N-糖链结构增加，N-钙粘蛋白介导的细胞粘附能力明显下降；而高尔基体内另外一种与GnT-V有竞争性的糖基转移酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ(GnT-Ⅲ)过表达，催化E-钙粘蛋白使其平分型的N-乙酰氨基葡萄糖链结构增加时，E-钙粘蛋白介导的细胞粘附能力增加。这些研究结果提示，N-糖基化结构的改变可能影响钙粘蛋白介导的细胞粘附，但N-糖基化如何影响E-钙粘蛋白介导的细胞粘附及其分子机制目前并没有报道。 本文的第二部分系统研究这一问题。 应用细胞聚集实验我们发现，E-钙粘蛋白N554、N566两个位点的N-糖基化显著影响E-钙粘蛋白的细胞粘附功能，去除这两个位点N-糖基化细胞粘附能力显著下降伴而迁移能力增加；而N618位点的N-糖基化似乎对于E-钙粘蛋白的粘附功能及细胞的迁移能力没有显著影响。在本文第三部分研究中，我们进一步探讨了N-糖基化影响E-钙粘蛋白细胞粘附功能的分子机制。我们首先应用放线菌酮初步分析N-糖基化对蛋白稳定性的影响。 研究发现，与N633位点显著影响蛋白稳定性不同，N554、N566和N618位点的N-糖基化基本不影响蛋白稳定表达。免疫荧光及Triton X-100抽提实验证实，这三个位点的N-糖基化也并不影响E-钙粘蛋白在细胞表面及细胞粘附连接处(adherens junctions，AJs)的表达，这样的结果说明，N-糖基化并非通过影响E-钙粘蛋白稳定性或E-钙粘蛋白在细胞粘附连接处的表达进而影响细胞粘附。那么，N-糖基化如何影响E-钙粘蛋白的粘附功能呢?我们随后的研究发现，去除E-钙粘蛋白N554，N566和N618位点的N-糖基化会引起β-连环蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高。而β-连环蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高往往会导致E-钙粘蛋白/β-连环蛋白复合物解体。接下来，通过对细胞粘附连接复合物进行分析，我们发现，去除E-钙粘蛋白N554、N566和N618位点N-糖基化后细胞粘附连接处β-连环蛋白及a-连环蛋白含量明显下降。因此我们得出结论，E-钙粘蛋白N554、N566和N618位点的N-糖基化通过影响β-连环蛋白的酪氨酸磷酸化水平，调节细胞粘附连接复合物中β-，a-连环蛋白的含量，最终影响细胞与细胞之间的粘附能力。 作为重要肿瘤抑制分子，E-钙粘蛋白能有效地抑制肿瘤细胞的增殖和转移，影响肿瘤的恶性行为。那么N-糖基化是否参与E-钙粘蛋白对肿瘤细胞生物学行为的影响?在本文第四部分的研究中，我们探讨了E-钙粘蛋白N-糖基化对细胞周期进程的影响。研究发现，在MDA-MB-435细胞中，野生型E-钙粘蛋白能够抑制周期蛋白cyclin Dl的表达，抑制细胞由Gl向S期转化，导致细胞出现Gl期阻滞；然而，随后的实验发现N554、N566及N618位点N-糖基化对于E-钙粘蛋白对细胞Gl/S转化的抑制效应是十分关键的，一旦去除这三个位点N-糖基化，突变E-钙粘蛋白似乎不能够抑制MDA—MB-435细胞由G1期向S期的转化。我们进一步研究发现E-钙粘蛋白这三个位点的N-糖基化通过细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路影响了MDA-MB-435细胞Gl/S期的转化。值得注意的是，N554、566两个位点的N-糖基化，尤其前者，显著影响E-钙粘蛋白对Gl/S转化的抑制。本论文研究发现，不同位点N-糖基化对E-钙粘蛋白稳定性及生物学功能的影响不同。N633位点N-糖基化显著影响E-钙粘蛋白的稳定性，而其它三个位点N-糖基化对蛋白稳定性影响不大。而N554、566位点N-糖基化通过影响β-连环蛋白酪氨酸磷酸化水平，影响E-钙粘蛋白的细胞粘附功能。另外，N554、566位点N-糖基化通过ERK信号通路影响细胞周期的进程，这可能由细胞粘附能力下降引起。而N618位点N-糖基化无论对于E-钙粘蛋白的粘附功能还是对于MDA-MB-435细胞周期的进程均无显著影响。

目录

论文说明：缩略词表

声明

引言

第一部分E-钙粘蛋白潜在N-糖基化位点N-糖基化鉴定及N-糖链结构初步分析

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分N554及N566位点N-糖基化影响E-钙粘蛋白介导的钙离子依赖细胞与细胞间粘附

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分N-糖基化影响E-钙粘蛋白细胞粘附功能的分子机制研究

材料与方法

结果

讨论

小结

第四部分E-钙粘蛋白不同位点N-糖基化对细胞周期进程的影响及分子机制研究

材料与方法

结果

讨论

小结

总结

综述 E-钙粘蛋白的研究进展

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