同种异体移植嗅鞘细胞修复wistar鼠神经缺损

摘要

目的：比较嗅粘膜胶质细胞、嗅球胶质细胞及雪旺细胞修复周围神经缺损能力是否不同，并优选出最适宜移植治疗周围神经缺损的胶质细胞。
　　 方法：
　　 (1)细胞培养、纯化及浓缩用60只2～3月龄Wistar鼠作嗅粘膜、嗅球神经层、坐骨神经的取材供体，将从Wistar鼠采集到嗅粘膜、嗅球神经层、坐骨神经分别用酶消化提取嗅粘膜胶质细胞、嗅球神经层胶质细胞、雪旺细胞进行原代培养、分裂增生、纯化、浓缩待用。
　　 (2)动物称重、编号、随机分组将81只成年Wistar鼠称重、编号，按随机种子200000，随机分成A、B、C、D三组；A组20只，为空白对照组，B组20只，为雪旺细胞组，C组20只，为嗅球神经层胶质细胞组；D组21只，为嗅粘膜胶质细胞组。
　　 (3)坐骨神经长段缺损动物模型的建立及细胞移植将左侧坐骨神经在离坐骨大孔3mm处切断，将远侧神经断端神经外膜翻转脱套，显露轴突，切除25mm长轴突，将远端神经外膜向近端复位，吻合于近侧神经断端，形成一个长25mm的神经外膜腔，将细胞培养液及培养纯化浓缩好的雪旺细胞、嗅球神经层胶质细胞、嗅粘膜胶质细胞分别植入A、B、C、D各组神经外膜腔内，并且于术前1h、术后第1d、术后第2d、术后第3d每只Wistar鼠腹腔内分别注射青霉素12万u/kg，链霉素12万u/kg，甲强龙30mg/kg，Wistar鼠饲养3m。
　　 (4)伤侧肢体功能评分于术后第3m末，对左侧伤肢踝关节进行肌力测定及疼痛反射测定，肌力评定标准参照人肌力评分标准制定，具体测定方法是利用牵拉悬空反射来观察伤侧踝关节及趾间关节，正常wistar鼠将鼠尾提起悬空双下肢，双下肢踝关节会反射性伸直，足趾会反射性伸直张开，而坐骨神经切断后，伤侧肢体该反射会消失。观察伤侧肢体此反射，以评定肌力，无肌肉收缩评0分，有肌肉收缩，没有关节运动1分；有关节运动不能对抗重力2分，对抗重力不能对抗阻力关节运动3分，对抗重力及足趾张开不能对抗阻力关节运动3.5分，能对抗轻度阻力4分，能对抗中度阻力为4.5分，能对抗重度阻力为5分。切断损伤神经远端，足趾出现疼痛性收缩1分，无反应0分；两项指标分数和为踝关节功能评分。
　　 (5)大体形态观察通过观察伤侧神经与健侧神经对比它们直径粗细、颜色差异及质地感、对比伤侧神经吻合口上下侧神经的直径、颜色及质地以观察神经再生情况。
　　 (6)荧光红逆行标记伤侧坐骨神经用10％荧光红荧光神经内注射逆行标记伤侧坐骨神经远侧断端，3d后将伤侧坐骨神经、脊神经节、相应节段的脊髓暴露，将伤侧坐骨神经远侧断端、神经外膜腔、伤侧坐骨神经近侧断端、相应的脊神经节、相应节段的脊髓取出-20℃下，OCT包埋冷冻切片，切成后25μm厚切片，荧光显微镜下观察逆行标记荧光红的运输距离及各采集点荧光红分布浓度。
　　 (7)免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibre acid protein，GFAP)浓度及神经生长因子(nerve growth factors，NGF)浓度在细胞移植术后第3m，以伤侧神经外膜腔为中心，切取一段长30mm的神经，-20℃下，OCT包埋冷冻切片，切成厚25μm切片，将一部分切片与5％牛血清蛋白于37℃湿盒中孵育封闭1h，再与兔抗鼠GFAP抗体(1:1000)37℃湿盒中孵育1h，PBS洗涤5min，荧光素.驴抗兔多克隆二抗(1:200)37μ湿盒内孵育1h，PBS洗涤5min，自然阴干，甘油/PBS(甘油：PBS=1:1)封片，荧光显微镜观察免疫复合物分布情况，从而反映GFAP浓度高低及分布情况，另一部分切片与5％牛血清蛋白在37℃湿盒中孵育封闭1h，再与兔抗鼠NGF抗体(1:500)37℃湿盒中孵育1h，PBS洗涤5min，荧光素.驴抗兔多克隆二抗(1:200)37℃湿盒内孵育1h，PBS洗涤5min，自然阴干，甘油/PBS(甘油：PBS=1:1)封片，荧光显微镜观察免疫复合物分布情况，从而反映NGF浓度高低及分布情况。
　　 (8)病理切片于细胞移植3m后，以伤侧坐骨神经外膜腔为中心取一段长30mm的神经进行石蜡切片，厚2μm，以Luxol fast blue法进行髓鞘染色及Mallory三色法进行染色，光学显微镜下观察，髓鞘形成情况，及髓鞘细胞分裂增生情况。
　　 (9)透射电镜检测于细胞移植术后3m末，以伤侧神经吻合口为中心切取一段长10mm的神经，用电镜标本固定液固定后，以EPON812包埋，以吻合口远端向近端逐次切取超薄切片，以柠檬酸铅染色，进行透射电镜观察。
　　 (10)酶联免疫方法检测髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)浓度及神经丝蛋白(neurofilament，NF)浓度于细胞移植术后3m末，以伤侧坐骨神经外膜腔为中心，切取一段长30mm的坐骨神经，于-70℃冰箱冷藏，待所有标本采集后，将神经组织匀浆，离心(40000g，10min)提取上清，按照MBP及NF的ELISA试剂盒说明书进行MBP及NF浓度测定。
　　 结果：神经缺损再生情况，肉眼观、光学显微镜及透射电镜观察，D组最完全，C组次之，B组较差，而A组最差，荧光红在神经中运行距离，D组最长，C组次之，B组较短，而A组最短；免疫荧光检测NGF、GFAP浓度、酶联免疫检测MBP及NF浓度均数、伤侧肢体功能评分均数(function)都是D组最高，C组次之，B组较差，而A组最低；三项均数组间差异具有统计学意义(p<0.05)。
　　 结论：嗅粘膜胶质细胞、嗅球神经层胶质细胞、雪旺细胞能促进坐骨神经缺损再生，嗅粘膜胶质细胞促进神经再生效果优于嗅球神经层胶质细胞及雪旺细胞，而嗅球神经层胶质细胞促进神经再生能力优于雪旺细胞。嗅粘膜胶质细胞引导神经纤维定向生长抑制瘢痕形成能力优于嗅球神经层胶质细胞及雪旺细胞。