Asia I型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的制备及其免疫原性分析

摘要

非特异性脂质转移蛋白（Nonspecific lipid transfer protein,nsLTP）是植物体内一类小分子量的碱性蛋白质。三级结构主要由四个α-螺旋组成,四个α-螺旋由四对二硫键相连,形成一个能结合各种脂质分子的疏水性孔穴。已有报道认为NsLTP参与了植物系统获得性抗性信号的传导,介导花粉黏附在柱头上并引导花粉管的伸长,推测它可能在细胞膜上存在受体。利用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）作为标记,研究了水稻nsLTP144在拟南芥中的定位,nsLTP144主要定位在细胞壁中,还有一部分和细胞膜相连,绿色荧光在细胞膜上呈不均匀分布;为了进一步研究nsLTP同细胞膜的连接,是否是nsLTP与细胞膜上的蛋白质以配体一受体方式作用的结果,我们采用放射性免疫结合分析法,利用放射性碘-125标记原核表达的两种nsLTP:Trx-nsLTP144、Trx-nsLTP110,再将其与水稻细胞质膜进行结合反应。发现125I-Trx-nsLTP144、125I-Trx-nsLTP110与水稻细胞质膜均具有特异性结合,而且结合是饱和性的、可被竞争的,符合配体-受体结合的典型特征,同时用于对照实验的蛋白质125I-Thioredoxin没有此特性,表明水稻细胞质膜上存在nsLTP的受体;利用可氧化糖基的NaIO4和水解糖基的N’-糖苷酶F处理水稻细胞质膜,再进行结合实验,结合活性几乎不受影响;而利用胰蛋白酶处理细胞膜则使得结合能力几乎完全丧失,表明其受体为没有经过糖基化修饰的蛋白质;利用交联剂BS3交联配体一受体后,再进行SDS-PAGE分离和放射自显影,结果显示水稻细胞质膜上的nsLTP受体中有一个60kDa的蛋白质可以与nsLTP144发生特异性的结合,可能是其受体;细胞外碱化实验表明,nsLTP144不能促使拟南芥原生质体细胞培养液的细胞外碱化反应,却能猝灭来自植物病原菌的激发子Cryptogein刺激拟南芥原生质体产生的细胞外碱化反应,表明nsLTP和Cryptogein结合细胞膜上相同的位点,保护了植物细胞免受Cryptogein导致的细胞程序性死亡,并诱导系统获得性抗性的产生;体外Pull-down实验表明,nsLTP144和水稻的OsCaM1具有相互作用,暗示了nsLTP144和OsCaM1可能同在一个信号通路上起作用。这些研究丰富了人们对nsLTP基因功能的认识,为进一步克隆其受体基因并最终阐明nsLTP介导的信号传导途径奠定了基础。ASKl（ARABIDOPSIS SKP1-LIKE）是SCF（Skpl-Cullin-F box蛋白）复合物中的一个重要成员,而SCF是泛素化降解途径中的一类E3酶,使靶蛋白标记上泛素标签,再通过26S蛋白酶体进行降解。为了分离由ASK1介导的泛素化降解的靶蛋白,我们利用双向电泳的方法比较拟南芥野生型和ask1突变体花苞全蛋白,选取在ask1突变体中比野生型中丰度高的蛋白质斑点以及野生型中比ask1突变体中丰度高的蛋白质斑点,作进一步的质谱分析。数据库检索发现,它们是一些和光信号传导途径、节律变化、逆境诱导、翻译后修饰以及细胞伸展或伸长相关的蛋白质,表明在ask1突变体中,这些过程受到了影响;还比较了这些蛋白质对应基因表达水平的变化,发现大多数基因的mRNA水平没有显著的变化,显示它们可能是在蛋白质水平受到了调控。对于分离出来的候选蛋白将有助于我们进一步认识和了解拟南芥发育过程中ASK1基因所起的作用,以及从蛋白质水平研究ASK1功能的重要性。