长链核酸扩增技术评价病毒灭活效果的研究

摘要

目的：HBV、HCV和HIV等经血传播的病毒对人类危害极大，我国仅HBV感染者就超过1.2亿。由于病毒感染窗口期的存在、新的病毒株不断出现以及检测技术还不完善等原因，通过输血或血液制品传播病毒性疾病的现象时有发生。为提高血液的安全性，有必要对其进行病毒灭活处理。在血液病毒灭活研究工作中，常用细胞感染法评价病毒的灭活效果。该法直接、客观，能够真实反映病毒失活的程度。但由于HBV和HCV等一些病毒目前还无法在体外培养复制，病毒灭活效果难以用细胞感染法进行直观评价，真实反映这些病毒的灭活效果仍是一个难题。本研究目的是探讨长链核酸扩增技术用于评价病毒灭活效果的可行性，探索病毒灭活评价的新方法。 方法：以pTAL-Seap质粒作为模型，通过特异性酶切(BSPH-I)及非特异性的60Co-T射线辐照(30kGy)损伤后行不同长度核酸片段(0.3kb、0.8kb、1．7kb、2.7kb、4.8kb)的PCR扩增，探讨长链核酸扩增技术评价DNA损伤的可行性。以具有体外致细胞病变效应(CPE)的伪狂犬病毒(Pseudorabievires，PRV)作为试验病毒。PRV大量复制后经60Co-γ射线辐照、低pH值(4.0±0.1)处理、巴氏法消毒(60+1.0℃(2)、有机溶剂/洗涤剂法(S/D法，0.3％TNBP+i％TWEEN-80)处理以及亚甲蓝/光化学法(MB/L，1.0uM亚甲蓝，40000Lux光照)灭活，提取灭活处理后的病毒核酸，以此作为PCR扩增的模板；同时将处理后的病毒接种Vero细胞，观察CPE，按照Karber氏方法计算残余病毒的滴度。 根据PRV的gD保守区域设计5条引物，预期扩增病毒核酸长度分别是0.28kb、0.56kb、1.4kb、2.6kb、3.9kb，同时设计一条共同的内上游引物，采用半巢式PCR技术再次扩增上述5条片段，探讨病毒核酸扩增片段长度与病毒感染性之间的关系。 结果：pTAL-Seap质粒经过特异性酶切后，酶切断点内的核酸片段扩增均为阳性，而跨越断点的核酸片段则扩增阴性：经30kGy的COCo．),射线辐照后，≥1．7kb的DNA长片段扩增阴性。用长链PCR技术可以反映质粒DNA的损伤情况。 PRV对60Co-γ射线辐照及低pH(4.0±0.1)法都很敏感，核酸受损情况随丫照射剂量的增加和低pH灭活时间的延长而加重。病毒灭活后，长片段核酸扩增结果(3.9kb)与细胞感染实验结果一致，用长链核酸检测技术可以评价60Co．Y射线和低pH法灭活病毒的效果。 PRV病毒经巴氏消毒法和S/D法灭活后，病毒核酸未受明显损伤，长片段的核酸扩增结果与细胞感染实验结果不一致，不适宜用长链核酸检测技术评价它们灭活病毒的效果。 PRV经MB/L灭活后，3.9kb以下的核酸片段扩增结果与病毒感染细胞实验结果不一致，与国外文献报道结果也不同，其原因有待于进一步探讨。 结论：长链核酸检测技术能够反映某些方法灭活病毒的效果，但有其局限性。它将有助于解决无细胞感染模型病毒灭活效果评价难等问题，也可作为现有病毒灭活评价方法的补充，使其评价结果更加可信、可靠。

目录

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引言

第一部分DNA损伤评价方法的建立及可行性研究

第二部分长链PCR技术评价病毒灭活效果的研究:实验一、PCR技术评价60Co-γ射线灭活病毒效果的研究

第二部分长链PCR技术评价病毒灭活效果的研究:实验二、PCR技术评价低pH法灭活病毒效果的研究

第二部分长链PCR技术评价病毒灭活效果的研究:实验三、PCR技术评价巴氏法和S/D法灭活病毒效果的研究

第二部分长链PCR技术评价病毒灭活效果的研究:实验四、PCR技术评价亚甲蓝/光化学法灭活病毒效果的研究

全文结论

参考文献

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