药物代谢酶CYP450基因热点突变功能及检测芯片的研究

摘要

细胞色素氧化酶P450(CYP450)是人体内一类参与内源性和外源性化合物代谢的重要代谢酶，代谢活化许多种药物、前致癌物、前毒物和致变剂。大约有60％的药物主要是由依赖CYP450s的代谢作用清除的。在CYP450酶系中，CYP4501～3家族得到了广泛而深入的研究，其功能和性质的研究尤为引人关注。 第一部分中，针对CYP2D6基因热点突变位点C188T和64268C，采用寡核苷酸芯片对240位健康志愿者基因组DNA标本进行了分型检测。将受试者的两个位点的野生型、杂合突变型和纯合突变型分型结果组合进行分析，并且进一步对CYP2D6芯片分型与药物代谢动力学参数实验结果的关系进行了阐述和讨论。芯片分型结果表明，CYP2D6ch等位基因在中国人群中出现的频率相当高，C188T和G4268C纯合突变型的比例分别达到了53％和54％，出现相应等位基因CYP2D6ch的频率与文献报道结果大体一致，并通过扩增产物直接测序验证了芯片的分型结果，两者具有良好的一致性。在中国人群中，CYP2D6酶确实有突变频率较高的等位基因存在。 同时选取同一群体中40位志愿者按照芯片分型结果分成4组进行药物代谢动力学实验(以酒石酸美托洛尔为探药)，采用高效液相色谱法检测了受试者体内血药浓度和药物代谢产物浓度。不同基因型志愿者体内药代动力学研究表明，第2组志愿者(CYP2D6*2H*10W／*2M*IOW)的所有药代动力学参数与第l组志愿者(CYP2D6*2W*10W)相比均没有显著性差异(P>0．05)。第3组志愿者(CYP2D6*2M*10H)与第1组志愿者(CYP2D6*2W*10W)相比较，美托洛尔tla延长33．8％，AUC0-32增加了90．3％，；而α一羟基美托洛尔的tl／2延长47．3％，AUCo-32降低了40．8％，C一降低了43．9％。尿中排出的代谢产物降低而原药则有所增加，CLo、CLform分别为第l组志愿者的46．9％和38％，但T一和Cmax均无明显变化。第4组志愿者(CYP2D6*2M*10M)与第1组志愿者(CYP2D6*2W*10W)相比较差异更大，美托洛尔ti／2延长93％，AUCo-32增加了149％，Cmax增加了30．8％；而α一羟基美托洛尔的ti／2延长79．1％，AUCo-32降低了62．6％，C一降低了60．2％。可以看出，药代动力学实验结果与基因分型结果预测的表型变化具有良好的一致性。 第二部分中，依据中国(或是亚裔)人群具有相对较高发生率和突变导致的功能变化已知的原则，选择了其中CYPlA2，CYP2D6，CYP2C19，CYP2C9和CYP3A4五个重要基因的8个多态性为研究对象。基于核酸固相杂交原理，设计制备出能同时检测不同CYP450多态性位点的基因分型芯片，并针对芯片杂交反应和杂交前PCR扩增两个环节进行优化。通过对PCR组分如Mg2+浓度、引物加入量和上下游浓度比值等条件的优化，来建立并完善两重PCR体系，并在此基础上成功建立了一个四重PCR体系；通过对探针的筛选，比较每组探针的信号比值获得了特异性最好的八对野生型和突变型检测探针；另外，比较了两种不同的样品处理方法后杂交结果的差异，分析并采用了简便、快捷的DNA提取方法。 综上所述，因此本研究制备的CYP450基因分型芯片特异性较好，技术较为成熟，可供作为一种新型基因型诊断试剂，在指导临床合理用药，避免严重的药物不良反应，开展个体化医疗等方面具有实际的应用价值。

目录

军事医学科学院研究生学位论文独创性声明及军事医学科学院研究生学位论文版权使用授权书

引 言

第一部分CYP2D6基因多态性与美特洛尔代谢的关系研究：引言

第一部分CYP2D6基因多态性与美特洛尔代谢的关系研究：材料与方法

第一部分CYP2D6基因多态性与美特洛尔代谢的关系研究：结果

第一部分CYP2D6基因多态性与美特洛尔代谢关系研究：讨 论

第一部分CYP2D6基因多态性与美特洛尔代谢关系研究：参考文献

第二部分CYP450代谢酶基因分型芯片的制备：引言

第二部分CYP450代谢酶基因分型芯片的制备：材料与方法

第二部分CYP450代谢酶基因分型芯片的制备：结 果

第二部分CYP450代谢酶基因分型芯片的制备：讨论

第二部分CYP450代谢酶基因分型芯片的制备：参考文献

致 谢

附件1：综述 药物基因组学的发展及其在个体化用药中的应用