口服减毒鼠伤寒沙门菌介导ePNP/MePdR自杀基因系统对荷瘤鼠协同抗肿瘤作用的研究

摘要

随着细菌学和分子生物学的发展,拓宽了细菌介导肿瘤治疗的思路,减毒沙门氏菌载体系统作为治疗恶性肿瘤的呈递工具逐步得到人们的认可。沙门氏菌是兼性厌氧菌,在好氧和厌氧环境都能生长,所以可在肿瘤的厌氧环境繁殖。为了使沙门氏菌成为安全的基因传递系统,通过突变代谢过程的基因来限制其致病性,降低毒性,使它可在生长旺盛的肿瘤中积聚。体内外实验发现,减毒沙门氏菌培养方便且可将含外源基因的质粒转至哺乳动物细胞内,促进了减毒沙门氏菌载体系统的应用。
　　 ePNP/MePdR自杀基因系统作为一种基因导向性酶前药治疗法(gene-directed enzyme prodrug therapy,GDEPT)正受到越来越多的关注。6-甲基嘌呤-2'-脱氧核苷(6-methylpurine-2'-deoxyriboside,MePdR)本身是无毒的药物前体,可被大肠杆菌(Escherichia coli)的嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,ePNP)分解成有毒的6-甲基嘌呤(6-methylpurine,MeP)。MeP会抑制DNA、RNA和蛋白质合成,高效杀伤肿瘤细胞;哺乳动物来源的PNP则不能分解MePdR。由于ePNP/MePdR自杀基因系统有强大的旁观者效应,可以杀伤非增殖期的肿瘤细胞,它被认为是治疗神经胶质瘤、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、黑色素瘤等人类恶性实体瘤的最佳选择之一。
　　 利用减毒鼠伤寒沙门氏菌介导ePNP/MePdR自杀系统,国际上还没有人尝试过。本研究采用减毒鼠伤寒沙门氏菌SC36(hisGaro A purI cys),它是由本实验室对SL3261进行二次DES诱变筛选而得的,属嘌呤和氨基酸双重缺陷株,毒性较SL3261更低。重组菌株携带的外源基因包括大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(ePNP)、鼠源的白介素-12(mIL-12)和胞嘧啶脱氨酶(CD),口服治疗常见的鼠源实体瘤(Lewis肺癌和B16F10黑色素瘤)。我们首先构建了CMV通用启动子调控下的ePNP基因表达载体pEGFP-C1-PNP。为了研究减毒沙门氏菌介导的pEGFP-C1-PNP在体内外表达情况,将pEGFP-C1-PNP,白介素-12(mIL-12)、胞嘧啶脱氨酶(CD)分别转化至减毒沙门氏菌SC36中。我们利用MTT,凋亡试验等试验,评估沙门氏菌介导的ePNP/MePdR单自杀基因系统、ePNP/MePdR和CD/5-FC双自杀基因系统,细胞因子mIL-12和ePNP/MePdR联合系统在体外杀伤肿瘤细胞的效应。体内实验结果显示,SC36能优先在肿瘤组织中集聚。荷瘤小鼠口服细菌实验结果表明,减毒沙门氏菌能够增强ePNP/MePdR自杀基因系统的抗肿瘤作用,而双自杀基因系统以及联合细胞因子的自杀基因系统可减少前药的用量,增强旁观者效应,有更好的应用价值。