在体电穿孔辅助BDNF基因眼内双腔转染延缓RCS大鼠视网膜色素变性的实验研究

摘要

第一部分
　　 脑源性神经营养因子绿色荧光蛋白融合表达载体的构建和提纯
　　 目的:构建pcDNA3.1/NT-BDNF-GFP-TOPO融合表达载体,并探讨其表达的融合蛋白的特性,为该质粒用于基因治疗研究的可靠性奠定基础。
　　 方法:利用分子克隆技术,用PCR方法从携BDNFcDNA的pRc/CMV载体中克隆出BDNFcDNA,然后将其片段插入pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO真核表达载体质粒中,并进行测序鉴定。
　　 结果:测序证实BDNF-GFP真核表达载体构建成功。
　　 结论:成功的构建BDNF-GFP融合表达载体,为使用该载体进行基因治疗的可靠性打下基础,并为基因治疗中目的载体的构建提供一个新思路。
　　 第二部分
　　 在体电穿孔辅助基因转染视网膜色素上皮细胞层的实验研究。
　　 目的:探讨在体电穿孔辅助基因转染视网膜外层的色素上皮细胞的可行性及适宜的电脉冲模式。
　　 方法:将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达质粒pEGFP-Nl注射到大鼠右眼视网膜下腔,左眼注射TEBuffer作为对照,按照电脉冲的不同电压(5、10、15、20、25、30、35V)进行分组,电脉冲模式为:电压×脉宽99ms,脉冲间期0.5s,连续5个脉冲。将带有负电荷的质粒在电场(角膜侧为负极,巩膜侧为正极)作用下,拟转染到色素上皮细胞层。转染后1周,取各组视网膜铺片,荧光显微镜下观察EGFP表达强弱、范围,及荧光细胞计数分析;采用免疫印迹法(Westernblot)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量观察EGFP蛋白和mRNA的表达。
　　 结果：以上各组电脉冲模式均能辅助基因转染至色素上皮细胞层,根据两极间距离将电压值换算成场强值,经组间对比,适宜的电脉冲模式为:10V/mm×99ms,脉冲I司期0.5s,5个脉冲。
　　 结论：电穿孔方法可以有效辅助基因在体转染大鼠色素上皮细胞层,将为非病毒方法辅助基因在体转染治疗视网膜色素变性类疾病提供一个具有潜在可能的新方法。
　　 第三部分
　　 在体电穿孔辅助BDNF基因眼内双腔转染延缓RCS大鼠视网膜色素变性的实验研究
　　 目的：以遗传性视网膜色素变性RCS大鼠为模型,探讨在体电穿孔辅助脑源性神经生长因子BDNF基因转染视网膜色素上皮细胞层和视网膜神经节细胞层治疗视网膜色素变性的可行性。
　　 方法：将编码BDNF的质粒注射至RCS大鼠右眼玻璃体腔或视网膜下腔,左眼注射TEbuffer或不治疗作为对照,随即以在体电穿孔法辅助基因转染。1周后采用Westernblot、RT-PCR半定量观察BDNF的表达,术后1、2、3、4、5、6周于光镜下观察视网膜外核层的变化,术后2周用原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况。
　　 结果：光镜观察术后各时间节点基因治疗眼视网膜外核层均较同期的对照眼厚度增加,存活的光感受器数量较对照眼多(P＜0.05)。Westernblot、RT-PCR可见BDNF蛋白和mRNA的表达。TUNEL结果显示对照眼和双腔转染治疗眼外核层阳性细胞凋亡指数分别为(43.58±3.72)％、(18.21±1.93)％,治疗眼TUNEL阳性细胞数较对照眼明显减少(p＜0.05)。
　　 结论：在体电穿孔辅助BDNF基因转染RPE细胞层、RGC层能够延缓RCS大鼠视网膜色素变性的病程。