初免加强免疫增强肺炎链球菌表面黏附素(psaA)核酸疫苗免疫原性研究

摘要

肺炎链球菌是导致细菌性肺炎、菌血症、脑膜炎等侵袭性疾病的重要原因,同时也是导致急性中耳炎和鼻窦炎的主要病原菌。由于抗生素的广泛运用,已导致多种耐药菌的产生。已经用于临床的预防疫苗主要为23价多糖疫苗和7价多糖蛋白结合疫苗,但前者是T细胞非依赖性抗原,对免疫系统发育不完善的2岁以下婴幼儿以及老年人的保护性有限;后者包含的血清型有限,而且生产成本高,不适合在我国大范围应用。
　　 PsaA是肺炎链球菌毒力因子之一,属于金属结合脂蛋白家族成员,分子量为37-kDa,有309个氨基酸残基构成,其氨基酸序列和免疫原性高度保守,属于ABC-型转运蛋白,PsaA在ABC型转运体系中属于细胞膜外蛋白质,一项功能是负责结合金属锰离子和锌离子;另一项功能是肺炎链球菌的一种黏附素。
　　 本研究根据基因库中肺炎链球菌表面黏附素的基因序列(序列号U53509),设计引物,运用PCR法从肺炎链球菌基因组中克隆出psad基因,回收PCR产物并对其进行酶切,将其分别插入到pVAX1真核表达载体和pET28a原核表达载体,分别构建出表达PsaA的核酸疫苗pVAX1-psaA及其重组原核表达载体pET28a-psaA,并对它们进行鉴定。将pET28a-psaA转化大肠杆菌BL21(DE3),经ITPG诱导,采用镍柱亲和层析法纯化PsaA蛋白,Western-blot分析其抗原性。
　　 10只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,将构建正确的核酸疫苗pVAX1-psaA对BALB/c小鼠(n=5)进行3次核酸疫苗免疫,隔周免疫一次,共3次,为初免,第三次免疫2周后,腹腔免疫50μg组PsaA纯化蛋白。对照组仅隔周免疫3针100μgpVAX1空载体,加强免疫50μl生理盐水。所有动物分别于0、2、4、6、7周尾静脉取血,间接ELISA法测定其抗PsaA抗体水平。
　　 本实验结果表明我们成功克隆出psaA基因并实现其亚克隆;所构建的psaA核酸疫苗序列正确,同时成功实现了PsaA蛋白纯化;动物实验结果表明核酸疫苗初免后蛋白加强组的抗PsaA抗体滴度明显高于其他组别(P＜0.01)。
　　 采用核酸疫苗初免.蛋白加强免疫策略能显著增强肺炎链球菌psaA核酸疫苗的免疫原性,为研制开发用于临床的肺炎球菌核酸疫苗奠定了基础。