重组人凝血因子Ⅶ的表达与纯化研究

摘要

人凝血因子Ⅶ(human coagulation factor Ⅶ，hFⅦ)是一种维生素K依赖的单链糖蛋白，由肝脏合成，在凝血过程中发挥着极其重要的作用，是凝血块形成起始的关键分子之一。 近年来的研究发现，FⅦ不仅适用于先天性和获得性FⅦ缺乏症的病人，而且还适用于治疗存在FⅦ和FⅨ抑制物的血友病病人，以及血小板减少症和血小板功能障碍病人的出血、止血和出血预防等；由于FⅦ能够结合暴露的组织因子(tissuefactor,TF)而启动外源性凝血途径，使其在战伤止血、严重创伤、无法控制的大面积外科手术的止血等方面具有独特的作用。 血浆中FⅦ的含量非常低，大约为20ff～400ng/ml，属血浆微量蛋白，难以规模化制备，而基因重组技术的发展为许多天然微量蛋白的规模化制备提供了可能。本研究就人凝血因子ⅦcDNA基因的克隆及其在哺乳动物细胞表达系统中的表达与纯化情况进行了探索。 本研究主要包括以下几部分： 1.人凝血因子ⅦcDNA基因的克隆及其在哺乳动物细胞中的表达 为了实现重组人凝血因子Ⅶ(recombinanthumancoagulation factorⅦ，rhFⅦ)在哺乳动物细胞中的表达，我们针对人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ，hFⅦ)cDNA序列设计引物，用反转录聚合酶链反应从人胎肝总RNA中钓取人凝血因子ⅦcDNA，将其克隆入pGEM-T载体中，通过酶切、PCR鉴定及序列测定，结果表明我们获得了全长为1335bp的hFⅦcDNA基因。 将测序正确的hFⅦcDNA基因亚克隆进真核表达载体pcDNA5/FRT/TO中，经过PCR和BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定，并将鉴定正确的载体命名为pTO-FⅦ。 利用脂质体转染法，将所构建的真核表达载体pTO-FⅦ和辅助质粒pOG44共转染Flp-In 293TR细胞系，通过75μg/mL的Hygromycin B压力筛选，获得抗性细胞；挑取抗性细胞的集落，通过有限稀释法进行细胞的克隆，获得了10株克隆细胞株；分别提取细胞的基因组DNA，应用PCR检测目的基因的整合情况；对于PCR检测阳性的细胞克隆，用含有四环素的表达培养基进行诱导表达，分别收集不同细胞克隆的表达上清进行SDS-PAGE及Western Blot检测，结果表明表达产物中有凝血因子Ⅶ的存在；用凝血因子Ⅶ促凝活性检测试剂盒进行活性测定，结果表明表达产物具有明显的促凝活性。说明成功实现了重组人凝血因子Ⅶ在哺乳动物细胞中的表达。 2．抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备及鉴定 应用杂交瘤融合技术，以重组人凝血因子Ⅶ为抗原免疫Bal b/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆等方法筛选出3株单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别是3E8、3D2、1C5，诱生的腹水效价分别为1：1×10<'7>、1：1×10<'6>、1：1×10<'6>。 用ELISA的方法分别对克隆化杂交瘤细胞株的亚类进行了鉴定，3株单克隆细胞株(3E8、3D2、1C5)的亚类分别是IgG2a、IgG1、IgG1：对单抗的特异性鉴定结果显示所制备的单抗与多种血浆蛋白均无交叉反应，表明单抗是特异的。 然后用388杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水，应用蛋白A亲和层析的方法进行单抗的纯化，经过蛋白A亲和层析，我们获得了纯化的单抗。 人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的成功制备与纯化，为建立人凝血因子Ⅶ检测及纯化方法奠定了基础。 3．应用单克隆抗体亲和层析法纯化重组凝血因子Ⅶ 将制备并纯化的388单抗与CNBr-Sepharose 6B Fast Flow进行偶联，制备单克隆抗体偶联的亲和层析介质McAb-Sepharose 6B FF，为了对制备的McAb-Sepharose 6B FF进行亲和层析验证，我们用重组凝血因子Ⅶ标准品进行了层析试验和条件的优化，结果表明我们所制备的层析柱能够特异性地结合重组凝血因子Ⅶ标准品；对层析条件进行优化，表明用20mmol/L的PBS作为结合缓冲液，含1mol/L NaCl的PBS作为洗脱缓冲液具有较好的层析效果。 在层析柱验证的基础上，我们开展了细胞表达重组凝血因子Ⅶ的纯化试验，首先将细胞表达上清用DEAE-Sephadex A-50进行吸附，吸附产物用Sephadex G-25脱盐柱进行脱盐处理并更换为结合缓冲液；然后将脱盐处理的表达产物用McAB-Sepharose 6B Fast Flow进行亲和层析，结果显示在用洗脱缓冲液洗脱时获得了单一的洗脱蛋白峰。 进而对洗脱蛋白峰进行SDS-PAGE、Western Blotting、促凝活性测定及肽质量指纹谱分析，结果显示纯化蛋白的相对分子量约为50kDa，与标准品分子量基本一致，进一步的验证结果表明，获得了纯化的重组凝血因子Ⅶ。 本研究在成功克隆中国人凝血因子Ⅶ的基础上实现了其在哺乳动物细胞中的可诱导表达，通过单克隆抗体的制备，建立了单克隆抗体亲和层析纯化rhFⅦ的简便方法。为今后rhFⅦ的研制奠定了坚实的基础。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

摘要

引 言

实验一人凝血因子Ⅶ在哺乳动物细胞中的表达与鉴定

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

实验二人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

实验三重组人凝血因子Ⅶ的纯化与鉴定

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

结 论

致谢

文献综述：人凝血因子Ⅶ研究进展

发表论文及申报专利

发表论文一

发表论文二

发表论文三