嗜热脂肪芽孢杆菌氨基酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆,表达及细胞固定化研究

摘要

甲硫氨酸是一个含硫的必需氨基酸,在饲料、医药、保健和食品工业领域都有着广泛的用途。甲硫氨酸是一个高附加值产品,也是我国为数不多需从国外大量进口的氨基酸之一。寻找成本低,产量高的甲硫氨酸生产工艺和方法成了近年来国内氨基酸生产领域的一个研究热点。
　　 本研究以嗜热脂肪芽孢杆菌为原始菌,从中克隆出氨基酰化酶基因,并转化到大肠杆菌中进行诱导表达,同时对菌体细胞进行了直接固定化研究,以N-乙酰-DL-甲硫氨酸为底物,探讨适合工业化拆分DL-甲硫氨酸的应用可能性。
　　 方法是以嗜热脂肪芽孢杆菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增出编码氨基酰化酶amaA基因,与pMD-18T vector重组,对阳性克隆菌的序列分析显示,与Genebank中amaA(Y08753)序列完全一致。用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切pET-28a(+)和pMD-18T vector阳性克隆,T4 DNA连接酶连接,构建了amaA-pET28a(+)的重组表达载体,转化到E.coli BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE分析和氨基酰化酶活性测定都表明,amaA基因在大肠杆菌中获得了高效表达。研究了IPTG的浓度,IPTG加入的时间和诱导表达的时间等。结果显示的最佳条件为:37℃,200rpm培养,菌浓度OD600在0.8～1.0之间时加入IPTG诱导,IPTG终浓度0.4mmol/L,诱导表达6h后,获得了氨基酰化酶活性为1,043U/g湿菌体。
　　 以N-乙酰-DL-甲硫氨酸为底物的拆分研究显示:底物浓度<0.08mol/L时,反应速度随底物浓度增加呈线性关系；55℃酶反应,游离菌的Km为4.5mmol/L,固定化后的Km为14.7mmol/L。酶学性质研究同时表明,65℃酶的催化效率最高,最适pH为7.0；固定化后酶pH稳定范围更广,热稳定性也更高；连续10批次拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸,活性仅损失20％左右；4℃条件下保存23天仍保留有固定化时73.6％的酶活性。菌体直接固定化研究显示,最佳条件为:3％卡拉胶包埋30％菌体细胞,以1.25％多乙烯多胺渗透交联固定化菌体细胞10min和0.1％戊二醛硬化处理20min,与未固定菌体比较,菌体固定化后仍保留有83％的酶活性。本研究显示,重组大肠杆菌表达的氨基酰化酶有着很好的应用前景。