肝癌缺失因子1在膀胱癌中的表达及其机制的研究

摘要

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。据美国癌症协会统计2006年美国膀胱癌在男性是继前列腺癌、肺癌和直肠癌以后排名第四位的恶性肿瘤,在女性排名第九位[1]。在我国,膀胱癌也是排名前十位的恶性肿瘤之一,多发于50岁以上的中老年人,随着年龄的增大发病率也相应增长,死亡率城市高于农村,男性高于女性。全球每年膀胱癌新诊断病例数约有27.5万、死亡病例数约10.8万[2]。膀胱癌多数为移行上皮细胞癌,以浸润的方式生长,复发率为50％～70％,大部分肿瘤患者的死因归结于转移灶的进行性生长[3,4]。膀胱癌的治疗多采用手术切除、放射治疗及全身化疗。手术、放化疗均有一定的效果,但是一般预后较差,极易复发及出现骨转移、肺转移等多发转移。膀胱癌大多数一经发现已为中晚期。对中晚期已有局部或远处转移的膀胱癌患者,临床上缺乏有效的治疗措施,手术难度大,即使勉强手术切除往往预后也较差。总之目前膀胱癌的诊断和治疗仍是一项困难课题。因此,进行膀胱癌的分子生物学相关机制研究,更多了解膀胱癌发生的分子事件,以便探知膀胱癌的发生、发展就显得尤为重要。
　　 以往人们普遍认为抑癌基因的异常失活或癌基因的激活是由于DNA结构突变造成的。突变导致某些基因获得额外功能或失去某种本己存在的正常功能,从而引发肿瘤的发生。近年来,随着对肿瘤研究的深入,人们发现DNA序列以外表观遗传学的调控机制异常在肿瘤的发生、发展过程中更为普遍,也起到重要作用。表观遗传(epigenetic)是指DNA序列并不发生变化而基因表达却发生了可遗传的改变。其主要机制是由细胞内除遗传信息以外的其他可遗传物质所诱发且在细胞发育和增殖过程中能够稳定传递[5]。表观遗传现象种类很多,但DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传现象与恶性肿瘤发生发展密切相关,特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活成为目前表观遗传学和表观基因组学在肿瘤研究领域内重要课题。例如,人们通过对基因启动子区域内CpG岛甲基化模式的研究,发现许多肿瘤都存在异常DNA甲基化现象。肿瘤抑制基因常常被过量的甲基化修饰而转录表达受到抑制,此时基因本身的结构并没有发生改变[6]。用去甲基化药物5.氮杂胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)作用于基因启动子高度甲基化的肿瘤细胞,发现能恢复其相应mRNA和蛋白的表达,而且表达水平随细胞的类型和药物剂量的改变而不同[7],从而证实启动子的甲基化是基因表达关闭的重要相关原因。结合肿瘤相关基因的功能研究及甲基化相关基因失活机制的研究,大量资料证明CpG岛超甲基化状态在肿瘤的发生发展中起到重要的作用,也是肿瘤发生中基因表达沉默的相关机制,尤其可能影响肿瘤抑制基因和错配修复基因转录表达,对肿瘤的发生和发展有着重要意义。在肿瘤早期诊断、评估肿瘤风险、肿瘤化学药物治疗中,异常DNA甲基化位点已经成为具有广泛应用前景的分子标志。
　　 近年来的研究发现,包括DAPK[8]、PTEN[9]、BLU[10]、RASSF1A[11,12]等多种肿瘤抑制基因在膀胱癌中均表现出不同程度的CpG岛超甲基化。肝癌缺失基因-1(frequentlydeletedinlivercancer,DLC-1)是近年来发现的新的抑癌基因。DLC-1位于人染色体8p21.3-p22区域,其基因cDNA全长3800bp,由14个外显子组成,编码的蛋白质产物含1091个氨基酸残基,分子量为122kDa,与大鼠p122RhoGAP基因有86％的同源,在多数人体组织均有表达[13]。DLC-1在乳腺癌[14]、肝癌[14]、结肠癌[15]、肺癌[15]、胃癌[16]和脑瘤[17]中发现其启动子的甲基化。目前对DLC-1在膀胱癌中的甲基化状态研究还未见报道。本研究通过检测DLC-1基因在膀胱癌中的甲基化状态和转录水平,以期为膀胱癌甲基化谱增加一名新成员,并探讨该基因在膀胱癌发生发展中的作用。
　　 我们用MSP法对52份膀胱癌组织DLC-1基因启动子甲基化状态进行检测,其中15份甲基化阳性,正常对照组未发现甲基化阳性病例,病例组和正常组差异有统计学意义(P＜0.001),说明在膀胱癌中DLC-1基因启动子存在异常甲基化。由于启动子的甲基化是基因沉默的主要机制之一,我们同时也采用荧光定量PCR技术和免疫组化技术在膀胱癌组织中检测其mRNA和蛋白表达水平,同样也发现分别有40.6％和31.1％的肿瘤组织DLC-1mRNA和蛋白表达缺失。甲基化的表达与mRNA表达缺失有相关性(P＜0.01),说明DLC-1甲基化与其基因表达下调有显著的相关性,显示其可能与膀胱癌的发生、发展有关。
　　 目前临床研究显示DLC-1基因是一个良好的表观遗传学标志物。DLC-1基因和它下游信号分子有可能成为有效的生物学标志物用于恶性肿瘤的早期诊断和治疗评估[18]。基因缺失或DNA甲基化均会导致DLC-1表达下调,这种现象可能提示肿瘤侵袭性进展。值得注意的是,DNA甲基化改变可发生在癌症形成的早期阶段,检测膀胱癌特异的DNA甲基化基因谱可能早期诊断细胞恶变。由于单一的甲基化标志物对诊断肿瘤缺乏特异性,目前肿瘤特异性甲基化谱(DNAmethylationprofile)对肿瘤的早期诊断意义正日益引起我们的关注。作为甲基化谱的一员,DLC-1基因的甲基化无疑对膀胱癌的早期诊断、预后评判都是有用的标志。