Orexin A通过NOS/NO系统调节应激性高血压大鼠心血管活动及针刺降压机制的研究

摘要

研究背景:长期、过度的精神紧张和心理应激是高血压的致病因素之一。现代生活节奏加快和社会竞争激烈使应激性高血压的发病呈逐年增加和低龄化趋势。Orexin A(OXA)是1998年发现的下丘脑神经肽，参与对进食行为、能量平衡、睡眠—觉醒周期等多种功能的调控。OXA免疫阳性神经元从下丘脑发出神经纤维投射到延髓头端腹外侧区(rVLM)，可能参与对应激反应和心血管活动的调控。针刺可降低应激性高血压大鼠的血压，其机制仍不清楚。
　　目的:本课题通过观察应激性高血压大鼠(SIHR)和经电针治疗的应激性高血压大鼠(SIHR+EA)的下丘脑腹外侧—穹隆周围区(LH-PFA) OXA免疫阳性神经元及rVLM区OXA特异性受体OX1R的表达变化;以及观察OX1R与nNOS和iNOS在rVLM区的共表达及NOS和sGC抑制剂对OXA在rVLM区引起的心血管效应的影响，同时检测该部位相关氨基酸递质释放的改变，探讨OXA在rVLM区可能通过NOS/NO系统，调节该部位兴奋性和抑制性氨基酸递质的释放比例，从而对心血管活动进行中枢调节，并参与应激致高血压和针刺降压的中枢机制。
　　方法:以足底电击结合噪音刺激建立条件反射为应激手段，连续应激14天制备应激性高血压大鼠模型（简称应激组大鼠）;另有一组大鼠在连续应激10天后，从第11天开始连续5天，每天加电针足三里穴位处理，制备应激性高血压加电针大鼠模型（简称电针组大鼠）;采用免疫组织化学(IHC)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)，观察应激组大鼠和电针组大鼠的LH-PFA区OXA免疫阳性神经元和rVLM区OX1R表达的变化;采用激光共聚焦结合免疫荧光双标技术，观察rVLM区OX1R与nNOS或iNOS的共表达情况;采用侧脑室注射的方法观察OXA对血压和心率的影响，并用硝酸还原酶法检测NO代谢产物NOx的含量变化。采用中枢核团微量注射的方法观察OXA在rVLM区对血压和心率的调节作用，以及nNOS、iNOS和sGC抑制剂对其效应的影响;采用微透析结合高效液相色谱荧光检测技术(HPLC-FD)，观察上述过程中氨基酸递质释放的改变。
　　结果:(1)大鼠经连续14天足底电击结合噪音的应激处理，动脉收缩压(SBP)和心率(HR)逐渐升高，应激第14天SBP由对照的110±5.4mmHg上升到142±7.6mmHg，HR由对照的372±19beats/min增加到420±23beats/min，与对照组大鼠的SBP和HR相比有统计学意义(p＜0.01，n=20)，说明应激性高血压大鼠模型制备成功。应激组大鼠体重增加明显减缓，应激第14天体重为270±14.6g，与对照组大鼠340±16.8g相比，有统计学意义(p＜0.01，n=20)。(2)电针组大鼠经电针足三里穴处理5天后，SBP和HR逐渐降低而体重增加，第14天SBP为115±9mmHg，HR为385±20beats/min，体重为297±13.3g与应激组大鼠的SBP、HR和体重相比，有统计学意义(p＜0.01/0.05，n=20)，说明电针对应激性高血压的治疗效果确切。(3) IHC结果显示，与对照组大鼠相比，应激组大鼠LH-PFA区OXA免疫阳性神经元表达明显上调，相对光密度值和神经元计数明显增加(p＜0.01，n=6)。经电针处理后，OXA免疫阳性神经元表达下调，相对光密度值和神经元计数均减少(p＜0.05，n=6)。(4) Western Blot结果显示，与对照组大鼠相比，应激组大鼠rVLM区OX1R的表达明显上调(p＜0.01，n=4)，经电针足三里穴处理后的电针组OX1R表达虽与应激组大鼠相比无统计学差异，但有下降的趋势。(5)激光共聚焦结合免疫荧光双标技术结果显示，rVLM区OX1R与nNOS或iNOS均有共表达，主要存在于细胞膜和细胞质中。OX1R与nNOS的共表达较与iNOS的多。OX1R在rVLM区神经元上有表达。(6)应激组大鼠单侧侧脑室注射OXA（0.01，0.1，1nmol/5μl）后，低剂量（0.01nmol）未观察到SBP和HR的明显改变，中、高剂量(0.1，1nmol)能引起SBP和HR呈剂量依赖性升高和加快。单独注射OX1R的选择性受体阻断剂SB-408124对血压和心率没有明显影响。但预先注射SB-408124再注射OXA，SB-408124可阻断OXA引起的升压和加快心率的效应。(7)应激组大鼠单侧侧脑室分别注射OXA（0.1 nmol，1nmol）、SB-408124(1nmol)或预先注射SB-408124(1nmol)再5min后注射OXA(1nmol)，20min后检测rVLM区NOx的含量，观察到随着OXA注射浓度的增加，NOx的含量逐渐降低，单独注射SB-408124对NOx的含量没有影响，但SB-408124能阻断注射OXA引起的NOx的含量下降。(8)正常组大鼠单侧rVLM区微量注射低剂量OXA(10pmol/0.1μl)，SBP和HR无明显变化，中、高剂量(50、100pmol) SBP和HR呈剂量依赖性的升高和加快。预先微量注射nNOS的抑制剂7-Ni(0.05pmol)或sGC的抑制剂Methylene Blue(100pmol)后5min再注射OXA(100pmol)，7-NI和MethyleneBlue可阻断OXA引起的升压和加快心率的效应。预先微量注射iNOS的抑制剂AG(10pmol)后5min再注射OXA(100pmol)，对OXA的效应没有明显影响。应激组大鼠单侧rVLM区微量注射低、中、高剂量OXA均可引起SBP和HR的增加，并呈剂量依赖性。应激组大鼠单侧rVLM区微量注射SB-408124可引起SBP和HR的降低，预先分别微量注射SB-408124、7-Ni或Methylene Blue再注射OXA，均可阻断OXA的升压和加快心率的效应，预先注射AG再注射OXA，对OXA的效应影响不大。电针组大鼠单侧rVLM区微量注射各药物后，引起的效应与在正常组大鼠注射引起效应基本一致。(9)应激组大鼠单侧rVLM区微量注射OXA(100pmol)、或预先分别注射7-Ni(0.05pmol)、Methylene Blue(100pmol)、AG(10pmol)再注射OXA，并于注射前10min，注射后第一个10min，第二个10min和第六个10min，rVLM区微透析出脑脊液用HPLC的方法检测氨基酸递质释放的变化，结果显示rVLM区微量注射OXA后，rVLM区透析液中兴奋性氨基酸Glu的释放明显增加，而抑制性氨基酸Tau和GABA的释放减少。预先注射7-Ni或Methylene Blue后5min再注射OXA，与单独注射OXA相比，rVLM区透析液中Glu释放明显减少，Tau稍有增加，GABA变化不明显。预先注射AG后5min再注射OXA，与单独注射OXA相比，上述氨基酸释放变化不明显。
　　结论:(1)应激性高血压大鼠下丘脑内OXA免疫阳性神经元表达增加，而rVLM区内则其特异性受体OX1R表达增加。(2)在rVLM区给予OX1R特异性受体阻断剂可降低应激性高血压大鼠的BP和HR，也可阻断外源性给予OXA引起的升压和加快心率效应。(3) OXA引起的BP升高和HR加快可能与rVLM区NO的含量减少有关。(4)OXA在rVLM区可能主要通过nNOS/NO-sGC途径，增加Glu的释放，也可能通过iNOS/NO途径，减少GABA释放来增强交感兴奋，参与应激性高血压的发病。(5)针刺能显著降低应激性高血压大鼠LH-PFA区OXA神经元和rVLM区OX1R的表达。针刺降压的机制之一可能通过减少rVLM区OXA的释放，调节nNOS/NO或iNOS/NO水平，进而影响兴奋性和抑制性氨基酸递质释放的比例，降低交感兴奋性，实现降压效应。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

材料和方法

1．材料

1．1 实验动物及一般处理

1．2 主要仪器和设备

1．3 主要试剂

1．4 常用试剂配制及处理

2．方法

2．1 应激性高血压大鼠模型制备

2．2 清醒大鼠动脉收缩压和心率的测定与记录

2．3 大鼠足三里穴位定位和针刺参数选择

2．4 大鼠脑组织取材及标本处理

2．5 免疫组化法检测下丘脑OXA免疫反应阳性神经元变化

2．6 激光共聚焦结合免疫荧光双标记技术观察rVLM区OX1R与NOS的共表达

2．7 蛋白免疫印迹法检测rVLM区OXl R的表达

2．8 侧脑室和中枢核团rVLM区微量注射

2．9 rVLM区一氧化氮的代谢产物(NOx)的检测

2．10 rVLM区微透析结合高效液相色谱检测氨基酸含量

3．实验数据统计学处理

结果

1．应激性高血压大鼠模型的制备及电针足三里穴对应激性高血压大鼠的影响

1．1 应激组大鼠和电针组大鼠在行为和体重方面的改变

1．2 应激组大鼠和电针组大鼠在血压和心率方面的改变

2．下丘脑0XA免疫反应阳性神经元的表达变化

3．OX1R在rVLM区的表达变化

4．rVLM区_OX1R与NOS的共表达

4．1 OX1R与nNOS在rVLM区的共表达

4．2 OX1R与iNOS在rVLM区的共表达

4．3 OX1R在rVLM区神经元上的表达

5．应激组大鼠侧脑室注射0XA和(或)SB-408124及rVLM区NO水平的测定

5．1 侧脑室注射OXA后对血压和心率的影响

5．2 侧脑室单独注射SB-408124或在其后注射OxA对血压和心率的影响

5．3 rVLM区NOx水平的测定

6．rVLM区微量注射OXA及其受体拮抗剂或NOS抑制剂对血压和心率的影响

6．1 rVLM区微量注射位点的鉴定

6．2 正常组大鼠注射OXA及其受体拮抗剂或NOS抑制剂对血压和心率的影响

6．3 应激组大鼠注射OXA及其受体拮抗剂或NOS抑制剂对血压和心率的影响

6．4 电针组大鼠注射OXA及其受体拮抗剂或NOS抑制剂对血压和心率的影响

6．5 rVLM区注射OXA及其受体拮抗剂或NOS抑制剂后血压和心率的变化

7．应激组大鼠rVLM区预先注射NOS抑制剂再注射OXA对氨基酸释放的影响

讨论

1．应激性高血压大鼠模型的评价

2．OXA和OX1R在应激性高血压大鼠脑内表达的变化及与应激反应的关系

3．OXA在应激性高血压大鼠下丘脑表达的变化与体重减轻的关系

4．单独注射OXA及其受体拮抗剂或NOS抑制剂对心血管活动的调节作用

5．OXA在rVLM区对心血管活动调节的可能作用机制

6．针刺对应激性高血压大鼠的治疗作用及其与OXA的关系

结论

参考文献

致谢

附录：读博期间发表和写作的论文

文献综述

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