五味子对大鼠肝CYP3A酶抑制和诱导双重作用机制的探讨

摘要

五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物北五味子(SchJsandrachinensisbail)的成熟果实,有增加中枢神经兴奋,增强人体精神、体力和心血管系统张力及心脏收缩力,降低病毒性肝炎患者血清谷丙氨酶等活性。我们的前期研究发现五味子水提物和醇提物在短期内可抑制CYP3A酶活性,而长期给药时却又产生诱导作用,但都来自独立的实验研究。同一味中药对CYP酶活性产生抑制机制与诱导双重调节的现象并不多见。结合文献研究提出一个假说,即五味子包括抑制组分和诱导组分:抑制组分直接作用于酶靶点,作用时间短,能迅速改变酶活性;而诱导组分在基因水平起作用,先增加mRNA表达,再提高蛋白表达,需经过一定时间才能看到酶活性的改变。我们之前的研究,已发现五味子木脂素中含有显著抑制CYP3A酶活性的组分。因此本课题旨在离体条件下继续考察五味子对CYP3A酶活性的影响性质及程度,验证以上假说并确定诱导组分,探讨其可能的临床意义。我们采用大鼠原代肝细胞模型,通过测定CYP3A酶的特异性底物睾酮代谢产物6β羟基睾酮的生成量来反映CYP3A活性;同时测定大鼠原代肝细胞中CYP3A1mRNA表达的情况,来研究五味子水提物、五味子甲素、乙素和醇乙对肝CYP3A酶的影响。且采用Westernblot法测定整体给药时大鼠肝微粒体CYP3A1酶蛋白的表达情况,初步研究五味子水提物对大鼠CYP3A1酶蛋白表达的影响。
　　第一部分：五味子对大鼠原代肝细胞中CYP3A酶活性的影响目的:研究离体条件下五味子水提物、五味子甲素和五味子乙素对大鼠原代肝细胞中CYP3A酶活性的影响。方法:提取并培养大鼠原代肝细胞,处理组加入生药浓度为O.075、O.75、7.5mg/m1的五味子水提物以及O.01～100PM五味子甲素和0.1～100μM五味子乙素,空白对照组为溶剂对照组,阳性对照组加入地塞米松(50μM),共同培养2d后加入CYP3A底物睾酮孵育3h,反应终止后用HPLC测定生成的代谢产物6β-羟基睾酮的浓度,代表CYP3A的酶活性。结果:(1)离体给药2天后,五味子水提物各浓度对大鼠原代肝细胞CYP3A酶活性都没有影响;(2)离体给药2天后,五味子甲素高浓度(100μM)可使大鼠原代肝细胞中CYP3A酶活性降低21％(P=0.004),而其余浓度无影响;(3)离体给药2天后,随着五味子乙素的浓度从1μM增加到100μM,大鼠原代肝细胞中CYP3A酶活性则出现逐渐降低的作用,高浓度(100μM)可使其酶活性降低39％(P=0.001)。结论:五味子水提物各浓度都对大鼠原代肝细胞中CYP3A酶活性无影响。五味子甲素在高浓度(100μM)时抑制大鼠原代肝细胞中CYP3A酶活性,其余浓度均无作用。此外,五味子乙素(1～100μM)对大鼠原代肝细胞中CYP3A酶活性有浓度相关性抑制作用。
　　第二部分：五味子对大鼠原代肝细胞中CYP3A1mRNA表达的影响目的:研究离体条件下五味子水提物及其单体五味子甲素、五味子乙素和五味子醇乙对大鼠原代肝细胞中细胞色素CYP3A1mRNA表达的影响。方法:(1)提取并培养大鼠原代肝细胞,处理组加入生药浓度为0.625、2.5mg/m1的五味子水提物,空白对照组为溶剂对照组,阳性对照组加入地塞米松(50μM),共同培养2d和3d后,用Trizol提取大鼠原代肝细胞的总RNA,经过RT-PCR测定生成的CYP3A1DNA含量,来反映大鼠原代肝细胞中CYP3A1mRNA的表达情况。(2)提取并培养大鼠原代肝细胞,处理组加入0.01、0.1μM血味子甲素和五味子乙素,以及5、10μM的五味子醇乙,对照组为溶剂对照组,阳性对照组加入地塞米松(50μM),共同培养2d后,用Triz01提取大鼠原代肝细胞的总RNA,经过RT-PCR测定生成的CYP3A1DNA含量,来反映大鼠原代肝细胞中CYP3AlmRNA的表达情况。结果:(1)离体给药2天后,五味子水提物高浓度(2.5mg/m1)可提高大鼠原代肝细胞中CYP3AlmRNA表达16％。而给药3天后,五味子水提物高浓度(2.5mg/m1)可诱导CYP3A1mRNA表达23％(P=0.022),同时血味子水提物低浓度(0.625mg/m1)对CYP3AlmRNA表达没有影响;(2)离体给药2天后,五味子甲素低浓度(0.0μM)使得大鼠原代肝细胞中CYP3AlmRNA表达增加16％,而高浓度(0.1μM)可增加55％(P=0.011);(3)离体给药2天后,五味子乙素低浓度(0.01μM)使得大鼠原代肝细胞中CYP3A1mRNA表达增加21％,而高浓度(0.1μM)可增加49％,有诱导趋势;(4)离体给药2天后,五味子醇乙低浓度(5μM)对大鼠原代肝细胞中CYP3A1mRNA表达没有影响,而高浓度(10μM)表达增加27％(P=0.045)。结论:给五味子水提物高浓度(2.5mg/ml)3d后,可诱导大鼠原代肝细胞中CYP3A1mRNA的表达,而低浓度(0.625mg/ml)无影响。五味子甲素(0.1μM)和五味子醇乙(10μM)都可显著诱导大鼠原代肝细胞中CYP3A1mRNA的表达,而五味子乙素(0.1μM)具有诱导CyP3AlmRNA表达的趋势。
　　第三部分：五味子水提物对大鼠肝微粒体CYP3A1酶蛋白表达的初步研究目的:研究五味子水提物对大鼠肝微粒体CYP3A1酶蛋白表达的作用。方法:大鼠灌胃给予五味子水提物(3g/kg),每日一次,于首次给药后6天,取肝组织制备肝微粒体,用Westernb1ot方法检测五味子水提物整体给药时CYP3A1酶蛋白表达,研究五味子水提物对大鼠细胞色素CYP3A1酶的影响。空白对照组仅给予蒸馏水,阳性对照组加入苯巴比妥(0.12g/kg)。结果:整体给药时,五味子水提物对大鼠肝微粒体CYP3A1酶蛋白的表达呈现诱导作用,使表达增加49％。结论:五味子水提物(3g/kg)可能诱导大鼠肝微粒体CYP3A酶蛋白的表达。