透明质酸通过诱导单核巨噬细胞耐受导致子宫内膜异位症

摘要

子宫内膜异位症(简称:内异症)是妇科最常见疾病,以子宫内膜出现在子宫腔以外为特征;近年发病率呈升高趋势。正常育龄期妇女约有50％～90％发生经血逆流;但仅有少部分人罹患内异症。说明大多数妇女的逆流子宫内膜碎屑能够被有效清除;而在内异症患者,由于盆腹腔局部免疫微环境改变,导致难以清除逆流子宫内膜碎屑。由于内异症的发病机制不甚清楚,目前临床尚缺乏积极有效的治疗方案。虽然免疫因素在内异症发病中的作用已引起广为注意,但其确切致病机制还亟待阐明。
　　单核巨噬细胞作为机体免疫应答的第一道防线,不仅能直接吞噬清除入侵抗原;作为抗原递呈细胞也能激活效应性和/或调节性T细胞,在固有免疫和适应性免疫均起重要作用。在内异症病灶局部高浓度趋化因子作用下,大量单核巨噬细胞从外周血被趋化至盆腹腔;然而这些巨噬细胞非但不能有效清除逆流的子宫内膜碎屑,反而通过分泌生长因子,促炎细胞因子和血管形成因子等,促进内膜在异位种植生长。因此,这些功能异常的单核巨噬细胞参与内异症的发病。探寻导致单核巨噬细胞的功能改变的因素,将为揭示内异症的发病机制,及寻找治疗新策略提供科学依据。
　　透明质酸普遍存在于细胞外基质,是分子结构非常简单的多聚糖,由重复的N-乙酰氨基葡萄糖和醛酸组成。透明质酸不仅作为组织骨架成分,且具有由分子量决定的多种生物学功能。在多种恶性肿瘤,癌细胞能够分泌高水平透明质酸,可诱导单核巨噬细胞耐受,实现免疫逃逸。然而,我们还不知道透明质酸是否在内异症的发病中起作用。
　　内异症是一种雌激素依赖性疾病,由于异位灶微环境升高的雌激素,对孕激素敏感性下降,使得受雌激素调控的基因异常表达,并与相关因子协同作用促进内异症的发生与发展。另外,环境污染物也参与内异症的发病,随着人类工业化进程的加速发展,环境因素可能是导致内异症发病率升高的另一重要因素。二嗯英(TCDD)是普遍存在的大气污染物,由含碳和氯燃料燃烧所产生,并可在大气中长期稳定存在。亲脂性的TCDD能够在人体脂肪组织中长期储存,具有类雌激素和抗雌激素的双重作用,因而参与内异症发病。
　　本研究假设是:内异症患者盆腹腔异常表达的透明质酸通过改变病灶局部免疫微环境,促进了子宫内膜在异位种植生长。本研究拟通过构建体外异位灶模型,探讨透明质酸在调节单核巨噬细胞功能中的作用,及其在内异症发生发展中的作用机制。
　　1、子宫内膜异位症盆腹腔透明质酸分泌水平及其调控机制
　　我们收集了15例内异症患者的腹腔液(Ⅰ～Ⅱ期6例,Ⅲ～Ⅳ期9例),并以13例非内异症生育期妇女腹腔液作为对照。应用ELISA方法分析腹腔液透明质酸水平,发现内异症腹腔液透明质酸水平明显升高;Ⅲ～Ⅳ期内异症较对照组升高约100倍;且腹腔液透明质酸水平与内异症的期别成正相关,即Ⅲ～Ⅳ期内异症显著高于Ⅰ～Ⅱ期内异症。
　　为了解析内异症腹腔液高水平透明质酸的来源,我们从异位灶及在位子宫内膜组织分离子宫内膜间质细胞(ESC);并从非内异症子宫内膜组织分离子宫内膜间质细胞作为对照。在不同浓度外源性雌孕激素(10-10～10-7M)及TCDD(0.01～10nM)作用下,用ELISA法检测细胞培养上清液的透明质酸水平。同期分析单核巨噬细胞透明质酸分泌水平。我们研究发现,单核巨噬细胞仅分泌低水平透明质酸,且不受雌孕激素及TCDD的影响。来自在位子宫内膜的ESC较异位灶ESC能够分泌更高水平的透明质酸;且两者均高于非内异症ESC的分泌水平。雌激素能够刺激上述三种ESC分泌透明质酸,以10。Sm作用最强;尤其对在位ESC的刺激作用最为明显。孕激素同样也能够刺激三种ESC分泌透明质酸,10-10M为作用最强,尤其对在位ESC的刺激作用最为明显。TCDD能够以剂量依赖性方式促进三种ESC分泌透明质酸,同样对在位ESC的刺激作用最为明显。我们应用雌孕激素序贯处理ESC,以模拟月经周期雌孕激素对ESC的调节作用。结果显示,孕激素能够明显抑制雌激素对透明质酸分泌的促进作用,尤其对非内异症ESC调节作用最显著。为了阐明雌激素与TCDD通过透明质酸介导内异症发生发展的机制,我们以雌激素和TCDD联合处理时发现,对于正常ESC分泌透明质酸,TCDD显示抗雌激素作用,即抑制雌激素的刺激效应;而对在位与异位ESC,TCDD起到了类雌激素作用,即与雌激素协同刺激透明质酸的分泌。这一结果表明,与来自正常生育期妇女的ESC相比,来自内异症患者的ESC对TCDD的反应性明显不同。
　　在三种透明质酸合成酶(HAS1,HAS2,HAS3)中,主要由HAS2合成大分子量透明质酸,是最重要的HA合成酶。为了进一步解析产生透明质酸的分子机制,ESC是否表达:HAS2,及是否受雌孕激素及TCDD的调控,我们用Incellwestern法分析了三种ESC在雌孕激素及TCDD的作用下HAS2的表达水平。结果显示:雌孕激素及TCDD均能促进三种ESC翻译HAS2;雌孕激素序贯处理显示,孕激素能够抑制雌激素对HAS2表达的促进作用,以正常ESC最为明显;TCDD对在位与异位ESC翻译HAS2起类雌激素作用;而对正常ESC翻译HAS2起抗雌激素作用,即抑制雌激素促进的HAS2表达。同样显示来自内异症的ESC与正常ESC的不同反应。
　　我们的研究结果显示,内异症盆腹腔透明质酸水平异常升高,主要由在位与异位ESC产生,并受雌孕激素调控和外源性污染物TCDD的影响,尤以在位ESC作用更为明显。因此,内异症盆腹腔异常升高的透明质酸可能参与内异症的发生发展。
　　2、外源性透明质酸能够诱导单核巨噬细胞耐受及存活
　　鉴于以上研究结果,我们进一步探讨了不同分子量的外源性HA在免疫耐受型单核巨噬细胞形成中的作用。我们发现暴露于高剂量的中分子量(MMW)和高分子量(HMW)的HA可诱导单核巨噬细胞向耐受型分化,表现为CD14表达上调,HLA-DR和CD86表达下调。虽然任何浓度的低分子量(LMW)和极低分子量(ULMW)的HA对单核巨噬细胞的极化状态均没有明显影响,但是四种不同分子量的HA均可上调单核巨噬细胞表面。HA受体CD44的表达。
　　我们还发现四种分子量的HA均能够明显抑制单核巨噬细胞的凋亡,表明HA能够通过促进耐受型单核巨噬细胞的存活,参与内异症的发生与发展。
　　3、ESC通过分泌透明质酸诱导单核巨噬细胞耐受导致子宫内膜异位症
　　由于ESC和单核巨噬细胞是异位灶微环境最重要的组成细胞,为了探讨ESC对单核巨噬细胞功能的调节,及透明质酸发挥的介导作用,我们建立了三种ESC与单核巨噬细胞的体外共培养模型。我们研究发现,在与在位和异位ESC共培养时,单核巨噬细胞表型发生了由活化型向耐受型的转变:表面CD14表达上调,HLA-DR和CD86表达下调;而且我们还意外地发现,这些单核巨噬细胞表面透明质酸受体CD44表达明显上调。这些免疫耐受型的单核巨噬细胞继而不能对LPS刺激产生激活反应;而与正常ESC共培养的单核巨噬细胞上述表型未发生明显改变。以上研究证据表明,与正常生育期妇女ESC比较,来自内异症患者的ESC对于诱导耐受型单核巨噬细胞,显示出不同的生物学行为。
　　为了弄清楚透明质酸是否介导单核巨噬细胞表型改变,我们预先用抗CD44单克隆抗体处理单核巨噬细胞,再与ESC共培养;或在共培养系统中加入透明质酸的拮抗肽或对照肽。研究发现,阻断透明质酸对CD44的作用,能部分废除在位与异位:ESC对单核巨噬细胞免疫耐受表型的升调节作用;而对正常ESC与单核巨噬细胞共培养系统无明显影响。
　　与三种ESC比较,单核巨噬细胞分泌明显高水平的IL-10。在与三种ESC共培养后,单核巨噬细胞分泌IL-10的水平明显升高;其中与在位与异位ESC共培养分泌更高水平IL-10。加入透明质酸拮抗肽能明显下调这一促进作用,提示共培养环境中透明质酸对单核巨噬细胞分泌IL-10的升调节作用。单核巨噬细胞也较三种ESC分泌明显高水平的IL-12p70;在位及异位ESC较正常ESC分泌略高水平的IL-12p70。与在位或异位ESC共培养,明显下调单核巨噬细胞IL-12p70的分泌:加入透明质酸的拮抗肽能显著抑制这一下调作用,提示培养环境中透明质酸对单核巨噬细胞分泌IL-12p70的降调节作用。
　　综上所述,内异症患者盆腹腔透明质酸水平明显升高;这些升高的透明质酸主要来自在位与异位ESC;雌孕激素及TCDD通过影响透明质酸合成酶的表达调节ESC分泌透明质酸的水平。异位灶微环境高水平透明质酸能够诱导单核巨噬细胞表型呈免疫耐受型,并促进其抑制型细胞因子IL-10的分泌,并下调其Thl型细胞因子IL-12的分泌;及促进单核巨噬细胞在这一微环境的存活,从而妨碍盆腹腔清除异位的子宫内膜碎屑,导致异位病灶的形成和发展。