基质金属蛋白酶对小体积肝移植物早期损伤作用机制的实验研究

摘要

第一部分：
　　不同体积肝移植物早期MMP-2/9差异性表达研究
　　目的:观察不同体积肝移植大鼠术后早期移植物MMP-2/9表达和活化的特点,探究MMP-2/9在不同体积移植物差异性表达的潜在机制,进一步探讨MMP-2/9在小移植物早期损害的作用。
　　方法:108只SD大鼠分为3组:100％肝移植、50％肝移植和25％肝移植组。分别检测移植物灌注后0.5、6、12、24、48和72小时的门静脉压力;肝功能(ALT、TB);肝组织MDA和MPO浓度;病理组织学改变。并采用ELISA,Real-timePCR,明胶酶谱和免疫组织化学方法检测各组移植物MMP-2/9蛋白量、基因水平、酶活性和组织中表达与定位。
　　结果:与全肝移植物比较,灌注后6-24小时MMP-9表达在小体积移植物明显升高(P<0.05),且MMP-9表达量与移植物体积呈负相关性(P<0.05)。MMP-9早期表达集中在肝移植物门静脉周围,与门静脉压力变化密切相关(P<0.05)。25％肝移植物灌注后6h内MMP-9活性较其他两组明显升高(P<0.05),并伴随了移植物肝窦扩张、出血、门静脉结构破坏。MMP-9表达和活性增高与小体积肝移植物严重的缺血再灌注损伤存在相关性,表现为肝功能(ALT、TB)指标损害,MPO和MDA值的升高(P<0.05)。MMP-2表达和活性在三个实验组各时间段均无统计学差异。
　　结论:MMP-9在小体积移植物早期表达和活性显著增加,移植术后门静脉高压(门静脉高灌注)可能是触发MMP-9活化和表达的重要原因。MMP-9是小体积肝移植物早期重要的致损伤因素,而MMP-2表达与小移植物早期损害无相关性。
　　第二部分：
　　MMP-2/9活性抑制对小体积肝移植物早期损害的作用
　　目的:通过早期抑制MMP-2/9活性来观察对小体积肝移植物损伤和移植受体生存率的影响,进一步验证MMP-2/9对小移植物早期损害的作用。
　　方法:SD大鼠分为3组:100％肝移植、25％肝移植和25％肝移植联合CTT(MMP-2/9活性抑制剂)干预组。分别检测移植物灌注后0.5、6、12、24、48和72小时的肝功能(ALT、TB)、肝组织MDA和MPO浓度、病理组织学改变;促炎细胞因子、肝细胞凋亡率及凋亡相关蛋白(Fas、Fas-L、Bax、Bak、Bim、Bcl-2)的水平;采用ELISA,Real-timePCR,明胶酶谱和免疫组织化学方法检测各组移植物MMP-2/9蛋白量、基因水平、酶活性和组织中表达与定位;三组再各选取10只模型大鼠进行为期2周的生存率观察。
　　结果:与全肝移植组比较,25％移植组灌注后6h出现MMP-9表达明显增高,并在12h达到峰值,MMP-2表达在各组无明显差异。与无干预小移植物组比较,经CTT干预后,小移植物在灌注后12h内MMP-2/9活性明显减弱(P<0.05),肝移植物功能(P<0.05)、肝组织MDA和MPO浓度(P<0.05)、病理组织学改变(P<0.05)、致炎细胞因子表达水平(P<0.05)、肝细胞凋亡率(P<0.05)均显著改善,部分凋亡相关蛋白表达明显改变(P<0.05),并且移植受体生存率明显提高(P<0.05)。
　　结论:MMP-9活性抑制可以显著改善小体积肝移植物早期损害,并提高小肝移植受体生存率。
　　第三部分：
　　MMP-2/9活性抑制对小体积肝移植物术后肝再生的影响
　　目的:观察早期抑制MMP-2/9活性对小体积肝移植物术后肝再生的影响。
　　方法:SD大鼠分为4组:75％肝切除、100％肝移植、25％肝移植和25％肝移植联合CTT(MMP-2/9活性抑制剂)干预组。观察各组术后24和48h门静脉压力、肝细胞有丝分裂指数(MI)、溴脱氧核苷尿嘧啶标记指数(BrdULI)、CD34标记微血管密度(MVD)以及术后HGF、IL-6、TNF-a基因表达水平的变化。
　　结果:肝切除组术后肝再生活性最强,表现为肝细胞增殖指数(MI)、BrdU标记指数和MVD在术后24和48h均较三个移植组显著增高(P<0.05);25％肝移植物术后再生活性减弱,肝再生进程的峰值时点后移;四个实验组中,全肝移植物肝再生活性最低(P<0.05);而CTT干预后48小时的各项指标与未治疗小移植物组无明显差异。75％肝切除组与各移植组比较,HGF、IL-6、TNF-a表达水平均明显增高(P<0.05)。术后48小时,CTT干预组与未治疗小移植物组比较,HGF、IL-6、TNF-a表达无明显差异(P>0.05)。
　　结论:MMP-9活性抑制对小体积肝移植术后早期肝再生无明显负面影响。