转录因子Slug对人前列腺癌细胞生长和转移的影响

摘要

目的:
　　通过对人前列腺癌细胞系PC-3、LNCaP、DU-145、22RV1的体外及体内实验,探讨前列腺癌细胞Slug的表达情况,以及Slug通过对细胞周期调节因子CyclinD1的调控影响前列腺癌细胞的生长,及Slug对前列腺癌细胞转移的影响。从而认为Slug可以做为一种新颖的治疗手段以预防和延缓前列腺癌的的进展。
　　材料和方法:
　　体外培养前列腺癌细胞系PC-3、LNCaP、DU-145、22RV1;构建质粒pMIGW-CyclinD1-HA和质粒pMIGW-CylinD1-HAT286A;SDS-PAGE及WesternBlot检测Slug、CyclinD1、CyclinD2、HA、α-Tubulin、β-actin蛋白的表达;利用表达Slug、CyclinD1-HA、CylinD1-HAT286A以及其空白对照的pMIG载体制备逆转录病毒(retrovirus),用表达Slug-shRNA以及其空白对照的pLK0.1载体制备慢病毒(lentivirus),并用制备的病毒感染PC-3和DU-145细胞系;提取前列腺癌细胞的所有RNA,并逆转录成cDNA;RT-PCR和Real-TimePCR检测Snai11、Snai12/Slug、Snai13、Scratch1、Scratch2、CyclinD1mRNA的表达。
　　流式细胞仪分别检测经过碘化丙锭(PI)染色的含有pMIGRI载体以及pMIGRI-Slug载体的两种PC-3细胞系的DNA含量进而分析其细胞周期的变化;用MTT法分别检测含有pMIGRI载体以及pMIGRI-Slug载体的两种PC-3细胞系的体外生长情况,用快速细胞增殖法分别检测含有pMIGRI载体、pMIGRI-Slug载体、pMIGW-CylcinD1-HA载体的两三种PC-3细胞系以及含有pLK0.1载体和pLK0.1-shSlug载体的两种DU-145细胞系的体外生长情况;把含有pMIGRI载体以及pMIGRI-Slug载体的两种PC-3细胞系分别注入NCR-nu/nu裸鼠的左右背部皮下构建体内肿瘤模型,从而检测两种细胞系在体内的生长情况。
　　DU-145细胞系分别加入0μ1、10μ1、20μ1、40μl表达人Slug的腺病毒,4天后WesternBlot检测Slug、CyclinD1蛋白表达变化,Real-TimePCR检测Slug、CyclinD1mRNA表达变化。在含有pMIGW-CyclinD1-HA载体和pMIGW-CylinD1-HAT286A载体的两种PC-3细胞系中分别加入0μ1、40μ1、80μ1、120μ1表达人Slug的腺病毒,5天后WesternBlot检测Slug、CyclinD1蛋白表达变化;在含有pMIGW-CyclinD1-HA载体和用0.1μM/LMG-132(泛素化信号通路抑制剂)处理的含有pMIGW-CylinD1-HA载体的PC-3细胞系中分别加入30μ1、60u1表达人Slug的腺病毒,3天后WesternBlot检测CyclinD1蛋白表达变化;免疫共沉淀法检测转染了pMIGW-Slug-HA载体的U20S细胞中Slug蛋白和CyclinD1蛋白的结合;免疫荧光双重染色激光扫描共聚焦显微镜技术检测同时转染pcDNA-CyclinD1-HA载体和pMIGW-Slug-GFF,载体的U20S细胞系中Slug蛋白和CyclinD1蛋白的结合情况。
　　划痕试验和基底膜基质试验检测含有pMIGRI载体以及pMIGRI-Slug载体的两种PC-3细胞系的体外侵袭能力。
　　结果:
　　与野生型小鼠的前列腺组织蛋白样品相比,转基因小鼠前列腺癌(TRAMP)模型的前列腺癌组织蛋白样品Slug蛋白表达量升高。Slug蛋白在PC-3、LNCaP、22RV1三种人前列腺癌细胞系中呈高表达,其中在LNCaP中的表达量最高,PC-3、22RV1次之。而在DU-145中的表达量最低。在Snai11、Snai12/Slug、Snai13、Scratch1、Scratch2五个Slug/Snail超级家族成员中,只有Slug在四种前列腺癌细胞系中的转录水平较为明显,且各细胞之间的表达量存在明显的差异(P＜0.05),其中在PC-3细胞系中的转录水平最高、DU-145、LNCaP次之,在22RV1细胞系中的转录水平最低。Slug在四种前列腺癌细胞系中的蛋白水平与转录水平无相关性。Slug的表达量与p53的表达量不存在负相关性。
　　与含有pMIGRI载体的PC-3和DU-145细胞系相比,含有pMIGRI-Slug载体的PC-3和DU-145细胞系生长速度变慢,两者生长曲线存在统计学的差异(P＜0.05)。与含有pMIGRI载体的PC-3细胞系相比,含有pMIGRI-Slug载体的PC-3细胞系G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,两者各时期细胞数目之间存在统计学差异(P＜0.05)。与含有pLK0.1载体的PC-3细胞系相比,含有pLKO.1-shSlug载体的PC-3细胞系生长速度变快,两者生长曲线存在统计学的差异(P＜0.05)。
　　与含有pMIGRI载体的PC-3细胞系相比,含有pMIGRI-Slug载体的PC-3细胞系的CyclinD1蛋白表达量下调。与含有pLK0.1载体的PC-3细胞系相比,含有pLK0.1-shSlug载体的PC-3细胞系的CyclinD1蛋白表达量上调。与阴性对照组相比,加入10μ1、20μ1,、40μ1表达人Slug的腺病毒4天后均可引起含有pMIGRI-Slug载体的DU-145细胞系的CyclinD1蛋白表达量下调,且呈剂量依赖关系;但其mRNA的表达量无明显统计学差异(P＞0.05)。与阴性对照组相比,加入40μ1、80μ1、120μ1表达人Slug的腺病毒5天后均可引起含有pMIGW-cyclinD1-HA载体的PC-3细胞系的HA-CyclinD1蛋白表达量下调,且呈剂量依赖关系,但含有pMIGW-CylinD1-HAT286A载体的PC-3细胞系的HA-CyclinD1蛋白表达量没有明显变化。与阴性对照组相比,加入30μ1、60μ1表达人Slug的腺病毒3天后均可引起含有pMIGW-CyclinD1-HA载体的PC-3细胞系的HA-CyclinD1蛋白表达量下调,且呈剂量依赖关系,但用0.1μM/LMG-132(泛素化信号通路抑制剂)处理的表达pMIGw-CylinD1-HA载体的PC-3细胞系的HA-CyclinD1蛋白表达量没有明显变化。免疫共沉淀法显示HA-Slug蛋白和CyclinD1蛋白被同时沉淀下来。免疫荧光双重染色激光扫描共聚焦显微镜技术显示在U20S细胞中与Slug相结合的绿色荧光蛋白(GFP)和与HA-CyclinD1相结合的红色荧光蛋白(RFP)部分重叠。与含有pMIGRI-Slug载体的PC-3细胞系相比,同时含有pMIGRI-Slug和pMIGW-CylinD1-HA载体的PC-3细胞系生长速度增快,两者生长曲线存在统计学的差异(P＜0.05),但与含有pMIGRI载体的PC-3细胞系的生长曲线无统计学差异(P＞0.05)。
　　划痕试验显示与阴性对照组相比含有pMIGRI-Slug载体的PC-3细胞系具有较强的细胞移动速度,而含有pLKO.1-shSlug载体的PC-3细胞系细胞移动速度较慢。基底膜基质试验显示与阴性对照组相比含有pMIGRI-Slug载体的PC-3细胞系具有较多的侵袭细胞数,两组存在明显的统计学差异(P＜0.05)。
　　结论:
　　Slug蛋白高表达于鼠的前列腺癌组织中。在PC-3、LNCaP、DU-145、22RV1四种前列腺癌细胞系中,Slug蛋白是呈选择性高表达的,且其表达可能受到转录和翻译后修饰水平调节。Slug的表达是不受肿瘤抑制基因p53调控的。Slug表达上调可以使细胞周期调节因子CyclinD1降解,从而使细胞周期G0/G1期延长,S期缩短,进而在体内和体外抑制前列腺癌细胞的生长。Slug表达上调引起CyclinD1蛋白降解主要不是通过Slug蛋白抑制CyclinD1基因的转录,而是通过Slug蛋白和CyclinD1蛋白相互结合在泛素化依赖信号通路的作用下完成的。Slug高表达可以促进前列腺癌细胞在体外的侵袭和转移。因而对Slug表达信号通路的调节可以作为前列腺癌重要的治疗手段。