人晶状体细胞膜流动性的年龄相关性改变及可溶性晶状体蛋白的调节作用

摘要

人的晶状体是一个特殊的器官,其赤道部的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)不断分化形成新的晶状体纤维,并向核区移行,在此过程中纤维细胞的细胞核和细胞器不断退化消失,仅留下透明的细胞质,从而形成了几乎不存在蛋白质更新的核区。这一核区担负着人眼调节的主要形变任务,同时它又是翻译后修饰的主要区域,双重的负荷使其容易受到各种年龄效应的影响。
　　随着年龄的增长,晶状体组织的硬度明显增加,尤其是核区,从而加速了老视和年龄相关性白内障的发生。由于晶状体核区的含水量并未发生明显的改变,这种硬度的增加与核区内纤维的累积关系不大。研究表明,到了中年,人品状体中50％原本可溶性的蛋白质变得不溶,从而使晶状体的硬度增加:而对红细胞和胆管细胞的研究表明,随着年龄的增长其细胞膜的流动性会不断下降。
　　那么人品状体细胞膜会发生什么样的年龄相关性改变呢,变的更致密还是流动性增加?它的改变是不是也是晶状体硬度增加的原因之一呢?本研究通过观察分析人晶状体细胞膜流动性的年龄相关性改变,探索促使其变化的可能原因,来明确这些疑问。
　　第一部分人晶状体细胞膜流动性年龄相关性改变的研究
　　目的：观察入晶状体细胞膜流动性的年龄相关性改变。
　　方法：23对人晶状体,22-83岁。每对中一个品状体制作冠状位切片,取中央部位的切片进行6-酰基-2-二甲酰氨基萘(6-acyl-2-dimethylaminonapthalene,Laurdan)染色,并用双光子共聚焦显微镜沿切片最长轴连续采集图像,用软件计算转换得到GP(Generalized Polarization)图,把来自同一切片的GP图像用ImageJ-MosaicJ软件组合后,分别测量中心点两侧距离为0.75,2,3,3.5,4,4.5mm处的GP值。每对中另一个晶状体用模具解剖成外部、屏障部、内部和核心部,进行脂质提取,并用质谱分析每个部分的胆固醇含量。
　　结果：20-40岁时,晶状体从外到内的细胞膜流动性几乎恒定;随着年龄的增加,人晶状体中央的细胞膜流动性逐渐增加,而距中心3.5mm以外的细胞膜流动性改变不明显。胆固醇的含量没有明显的年龄性或区域性改变。
　　结论：人晶状体核区的细胞膜流动性随年龄增加而增加,这与胆固醇含量的变化并不相关。
　　第二部分人晶状体细胞膜流动性与可溶性晶状体蛋白含量改变的相关性研究
　　目的：分析人晶状体细胞膜流动性与可溶性晶状体蛋白含量改变的相关性。
　　方法：3对晶状体,年龄分别为31,40,63岁,每对中的一个晶状体直接制作冠状位切片,另一个晶状体则在50℃:加热20小时后制作冠状位切片,切片的染色观察如第一部分。所有切片后剩余的组织用模具解剖获得核心部位组织,用凝胶过滤HPLC分析可溶性晶状体蛋白含量。另取一对38岁的晶状体,一个晶状体用模具获得直径6mm以内的核组织,均分成5块,另一个晶状体进行连续切片,以1块组织和3个切片为一组,分别在50℃加热0,4,8,16和24 h,分析可溶性晶状体蛋白含量改变,并测量各组切片的GP值改变。
　　结果：50℃加热后,晶状体内部细胞膜流动性显著增加,同时α,α的高分子聚集物(high molecular weight,HMW)和β晶状体蛋白的含量下降。随着加热时间的延长,晶状体内部的GP值呈现与可溶性晶状体蛋白含量一致的下降。
　　结论：晶状体细胞膜流动性的改变与可溶性晶状体蛋白含量的变化可能相关。
　　第三部分可溶性晶状体蛋白与二氢鞘磷脂(dihydrosphingomyelin,DHSM)囊泡的结合实验
　　目的：研究品状体细胞膜流动性与可溶性晶状体蛋白是否存在直接联系。
　　方法：用人晶状体内含量最高的磷脂成分DHSM制作0.1mg/ml囊泡溶液,并在实验开始前1小时加入Laurdan标记。分别配制12.5,5,2.5,1.25mg/ml的α,β,γ晶状体蛋白溶液,各取10μL与240μL囊泡混合后,最终晶状体蛋白浓度分别为0.5,0.2,0.1,0.05mg/ml,结合半小时后,用荧光计测量各组GP值变化。
　　结果：随着α和β晶状体蛋白浓度的增加,GP值逐渐升高,膜的流动性下降,而γ晶状体蛋白浓度改变对GP值没有影响。
　　结论：α和β晶状体蛋白能够影响晶状体细胞膜的流动性,而γ晶状体蛋白不具备该功能。