MicroRNa-34a在年龄相关性白内障的表达改变及其对人晶状体上皮细胞凋亡作用的机制研究

摘要

引言：年龄相关性白内障(ARC)是全球致盲眼病的主要原因，手术仍是目前唯一的治疗途径，随着当今社会老龄化的进展，白内障手术需求量将逐年增加，给国民带来了巨大的经济负担。因此深入研究ARC的根本发病机制，以期找到早期有效的干预措施，具有重要意义。机体衰老是个复杂的过程，也是生命科学领域一直以来想要攻克的难题，其中包括晶状体的老化，即白内障形成，也是机体内外各种环境、代谢因素参与致病的结果。已有研究证明表观遗传调控与环境危险因素和其他调节因素存在密切联系，因此推测其在ARC复杂的发病机制中起着重要的作用。表观遗传学调控基因表达的机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰及微小RNA(microRNA)，是不涉及DNA序列改变的基因组修饰作用。其中microRNA是一组单链、内源性的非编码小RNA，通常与靶基因序列3'UTR特异性结合，在转录水平调节基因的表达，参与调节细胞的生长发育、分化、增殖、凋亡、应激及衰老等生物学进程。往年microRNA一直是肿瘤、血液中的研究热点之一，而其在眼部疾病中的作用却较少引起学者关注，近年来microRNA在眼科疾病中的研究也已初步展开。首次报道显示microRNA的表达谱在人透明晶状体上皮与白内障晶状体上皮中有显著差异，这提示microRNA的异常表达在晶状体发育、白内障发生发展过程中起着重要的作用。基于目前的研究现状，本文将着重研究microRNA参与ARC发病机制的具体分子机制，在体内筛选、验证microRNA在ARC中表达的改变，在体外探究microRNA诱导人品状体上皮细胞功能学改变的具体分子机制，并试图探索在ARC中异常表达的microRNA启动子DNA甲基化是否参与调控，是否共同相互作用参与ARC的发病机制。
　　第一部分 MicroRNA-34a在ARC的表达及其启动子甲基化水平
　　目的：探讨microRNA-34a(miR-34a)在年龄相关性白内障(ARC)中的表达及其启动子甲基化程度改变。
　　方法：收集ARC晶状体前囊膜30例，透明晶状体前囊膜18例，采用RT-PCR检测miR-34a和miR-933的表达水平，并评价其表达在两组间的差异;选择在ARC组较对照组表达差异最显著的miR-34a为研究对象，在12例ARC前囊膜及8例透明对照前囊膜组织进行焦磷酸盐测序，检测miR-34a启动子区DNA甲基化程度。
　　结果：miR-34a在白内障组表达高于透明晶状体组，miR-933的表达水平未见明显差异;其启动子甲基化程度在两组间无显著差异。
　　结论：miR-34a在ARC前囊膜表达升高，可能参与了ARC发病。
　　第二部分MicroRNA-34a调控人晶状体上皮细胞凋亡相关功能研究
　　目的:研究miR-34a对HLECs凋亡的影响。
　　方法:体外培养人晶状体上皮细胞系SRA01/04，将miR-34a双链模拟物(miR-34a mimics)和阴性对照模拟物(negative mimics)分别转染至人晶状体上皮细胞系。转染后24至72小时，流式细胞仪分析miR-34a转染后细胞凋亡的改变，并检测caspase3/7活性;Western Blot寻找上游激活靶蛋白;荧光显微镜观察JC-1染色后线粒体内膜电位改变，WB检测细胞质及线粒体细胞色素C(Cyto C)含量评价线粒体外膜功能;提取细胞总RNA，分析线粒体呼吸链上相关功能基因的表达;DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧积聚程度。
　　结果:miR-34a mimics转染48小时后SRA01/04发生早期及晚期凋亡的比例较对照组增加，活化的caspase3/7表达升高。JC-1染色提示miR-34a过表达导致晶状体上皮细胞线粒体内膜电位下降，WB显示Cyto C的含量在胞浆中显著大于线粒体内，说明线粒体外膜通透性增加、功能受损;同时线粒体呼吸链上相关基因NDUFS8、COX5b和ATP5a1表达明显下降，提示线粒体呼吸链电子传递功能受损;DCFH探针荧光在miR-34a组显著高于对照组，提示miR-34a过表达导致自由基产生，使胞内活性氧基团（ROS）蓄积诱发氧化应激反应。
　　结论:晶状体上皮细胞中miR-34a过表达可通过损伤线粒体功能而导致细胞凋亡。
　　第三部分 MicroRNA-34a调控人晶状体上皮细胞凋亡的机制研究
　　目的:研究miR-34a在转录水平调控人晶状体上皮细胞凋亡的具体机制。
　　方法:联合利用生物信息学分析网站(Pictar、TargetScan、MiRanda)筛选miR-34a的候选靶基因，绝对定量PCR验证晶状体上皮细胞中候选靶基因的表达，在转染miR-34a模拟物与阴性对照模拟物的SRA01/04中利用相对定量PCR和WB检测靶基因表达;构建miR-34a与靶基因3'UTR互补结合的质粒，共转染至HEK293-T细胞，并用双荧光素酶报告基因分析在转录水平进行靶基因验证。确定靶基因后，转染靶基因的si-RNA以实现靶基因敲减，再次利用流式细胞、caspase3/7活性与caspase9的WB评价细胞凋亡及线粒体功能的改变。
　　结果:筛选出靶基因Notch1、Notch2、Jag1、Jag2均位于Notch通路并在晶状体上皮中表达，Notch1及Notch2是此通路中关键的受体蛋白基因，PCR及WB显示在转染miR-34a模拟物的晶状体上皮细胞中Notch1及Notch2的表达较对照组受到抑制;双荧光素酶报告基因分析显示Notch1和Notch2的3'UTR萤火虫活性在miR-34a过表达组显著抑制，而突变型质粒则对miR-34a过表达及阴性对照组间萤火虫荧光活性无明显改变，由此确定miR-34可直接与Notch1、Notch2的3'UTR结合抑制其表达。进而在晶状体上皮细胞中将Notch1及Notch2基因敲减，进行流式凋亡功能检测及caspase3/7活性检测，发现Notch1敲减组细胞凋亡及caspase3/7活性增加不显著，而Notch2敲减组细胞早期及晚期凋亡显著增加，caspase3/7活性也较对照组显著升高。并且在Notch2敲减组的晶状体上皮细胞中线粒体凋亡标志蛋白caspase9的表达显著升高。
　　结论:miR-34a通过抑制靶基因Notch2表达诱导晶状体上皮细胞凋亡。

目录

英文缩略语注释

摘要

前言

第一部分 MicroRNA-34a在ARC的表达及其启动子甲基化水平

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 MicroRNA-34a调控人晶状体上皮细胞凋亡相关功能研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 MicroRNA-34a调控人晶状体上皮细胞凋亡的机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

综述 表观遗传学在年龄相关性眼病的研究进展

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