CpG ODN对非小细胞肺癌放射增敏作用的实验研究

摘要

据世界卫生组织统计全球每年肺癌新发病例超过120万，每年因肺癌而死亡的人高达约110万，已经成为第一癌症杀手。非小细胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的85％以上。放疗在NSCLC综合治疗中占据了重要地位，但癌细胞自身对放射线的抗拒性往往导致放疗失败，寻找行之有效的放射增敏剂是多年来肺癌研究领域倍受关注的热点。既往研究证实，含有非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN oligodeoxynuclcotide，CpG ODN)可激活机体免疫系统，从而增强多种抗癌措施的疗效；但近年的文献报道，CpG ODN可直接诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞生长，并对NSCLC和前列腺癌有化疗增敏作用。诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的关键，对放疗敏感的癌细胞较不敏感细胞更易进入放射线诱导的细胞凋亡过程。而目前CPG ODN是否能增强人NSCLC细胞放射敏感性尚未见报道。
　　在本研究的第一部分，为了探索CpG ODN对人NSCLC放射增敏作用及其可能作用机理，我们以人肺腺癌A549细胞株为观察对象，首先用MTS法检测不同浓度CpG ODN7909(5，10，30，60μg/ml)分别作用24 h、48 h后，对A549细胞活力的影响。结果表明，CpG ODN7909可直接抑制A549细胞活力，并呈剂量和时间的依赖性。随后将A549细胞随机分为四组：空白对照组、CpGODN7909组、照射组、CpG ODN7909+照射组。并用克隆集落形成法检测各组细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞凋亡情况及细胞周期分布；ELISA法检测细胞培养液中肿瘤坏死因子(TNF-α)的浓度。结果表明，CpG ODN7909(10μg/ml)联合照射组与空白对照组相比，细胞克隆存活分数降低、细胞凋亡率明显增高、细胞周期G2/M期阻滞、TNF-α因子分泌增多。随后我们用RT-PCR法检测A549细胞TLR9的mRNA的表达。结果表明，A549细胞表达TLR9，但CpG ODN7909是否通过A549细胞内TLR9信号途径起放射增敏作用，还有待于进一步的研究。因此，我们认为CpG ODN7909(10μg/ml)能有效提高A549细胞放射敏感性，为今后临床上使用CpG ODN7909联合放疗治疗非小细胞肺癌提供了实验依据。
　　本课题组在之前体内试验中发现，CPG ODN1826(每只小鼠腹腔注射0.3mg)可通过增强小鼠免疫功能来提高C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤放射敏感性。为进一步探索CPG ODN1826对C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤放射增敏作用的剂量效应，本研究第二部分，我们以Lewis肺癌移植瘤模型为对象，首先将成功建立Lwowis肺癌移植瘤模型随机分为6组，每组8只：对照组(腹腔注射PBS液)、X线照射组(单纯给予分次照射：250 cGY/fx，共1250 cGY/5fx)、CpG ODN组(每只小鼠腹腔注射CpG ODN1826，注射时间为第1，2，9天，共0.3 mg)及低、中、高剂量CpG ODN联合X线照射组(每只小鼠腹腔注射CpG ODN1826联合分次照射，CpG ODN总剂量分别为0.15、0.3、0.6 mg)(注射时间及照射方法同上)；其次随移植瘤的生长，定期观察荷瘤小鼠一般生存状况、移植瘤生长情况、小鼠免疫功能(脾指数)、TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况等。研究结果表明，CpG ODN有利于改善荷瘤小鼠一般生存状况，并呈剂量依赖性；且各处理组与对照组相比，肿瘤生长速度减慢，肿瘤绝对生长延迟时间(AGD)延长，其中高剂量CPG ODN联合照射组AGD最长，为9.0天，放射增敏比(SER)为17.9；CPG ODN组和CPG ODN联合照射组与对照组、单纯照射组相比，瘤重明显减轻(p<0.05)，且抑瘤率随着CPG ODN浓度增高而逐渐增大；单纯CPGODN组和中、高剂量CPG ODN联合照射组脾指数分别为(19.13±2.19)mg/g、(17.41±3.25)mg/g、(22.45±0.73)mzJg，与对照组(11.97±3.73)mg/g、单纯照射组(12.71±3.33)mg/g相比增大，有统计学差异(p<0.05)；单纯X线照射组、CpG ODN组及低、中、高剂量CPG ODN联合X线组移植瘤细胞凋亡率分别为(5.78±1.32)％、(14.12±2.89)％、(12.42±2.41)％、(20.89±4.87)％、(28.63±2.69)％，均高于对照组(2.67±2.14)％(p<0.05)。因此，CpG ODN1826可通过改善小鼠一般生存状况、抑制肿瘤生长、增强小鼠的免疫功能、促进移植瘤细胞凋亡等途径，明显提高Lewis肺癌放射敏感性，且呈剂量依赖性。