CHEK2与REV3L基因多态的肺癌易感性关联与机制研究

摘要

第一部分：
　　肺癌的发生是一个多因素、多阶段、长期相互作用的结果。肺癌的发生与环境暴露引起DNA损伤后的修复能力密切相关,而细胞周期检控点是维持细胞基因组稳定性的一个重要机制,其中DNA损伤检控点能检测细胞在生命活动过程中出现的DNA损伤并引发细胞周期阻滞,为修复损伤提供足够的时间。CHEK2基因在细胞周期调控中发挥了重要作用;当DNA出现损伤时,ATM与ATR激活CHEK2蛋白,后者将这一信号传递给能磷酸化E2F-1、BRCA1和P53等多个蛋白,启动细胞周期检验点调控。目前已发现CHEK2基因突变与乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤的发生具有密切的关系。
　　我们推测CHEK2基因启动子上的遗传变异可能会影响CHEK2基因最终的表达量,影响个体肺癌易感性的差异,为了检验这一假设,我们采用了病例一对照的研究方法,选择了该基因近端启动子上-122C＞G与-48G＞A两个单核苷酸多态(SNP)位点,利用Illumina分型方法对500例中国汉族肺癌患者和517例年龄、性别与之相匹配的正常对照进行了基因分型,研究了不同等位基因型和基因型与肺癌风险的相关性;然后在另外575例肺癌患者和589例对照人群中验证该多态和肺癌易感性的相关性。我们还进一步通过荧光素酶、凝胶迁移率电泳、染色质免疫共沉淀等方法深入的探索了阳性位点的功能。
　　在单位点分析中,我们发现CHEK2的启动子多态-48G＞A(rs2236141)位点的等位基因型分布在病例和对照中存在显著的统计学差异,P值为0.0018。非条件logistic回归分析表明,rs2236141位点的突变杂合基因型可以显著降低患肺癌的风险(与GG基因型相比,GA基因型的校正OR=0.65,95％CI=0.40-0.85)。而rs2236142多态与肺癌风险没有显著相关性。在验证性关联分析中,我们发现rs2236141多态的基因型分布在病例和对照中也存在显著的统计学差异(P=0.014)。两次关联分析结果合并后,rs2236141多态的基因型分布在病例和对照中存在显著的统计学差异(P=0.001);rs2236141位点的突变杂合基因型可以显著降低患肺癌的风险1.4倍(P=4×10-4)。
　　功能研究表明,在正常人外周血和肺组织中,A等位基因型的个体CHEK2mRNA水平高于G等位基因型个体。由于G→A转换可能减少一个甲基化位点(CG→CA),因而该多态可能影响表观遗传学调控。荧光素酶试验表明,G/A等位型启动子表达没有显著差异:但在甲基化条件下,等位型A等位型启动子对于显著高于A等位型。凝胶迁移率电泳实验和表面等离子共振实验表明甲基化的G等位型启动子能增强转录因子的结合。采用体内染色质共沉淀实验表明,结合在该多态附近的转录因子为Sp1,且该转录因子起负调控作用。
　　本研究表明CHEK2基因启动子rs2236141多态与中国人群中肺癌的发病风险具有显著相关性;该多态位点为功能位点,突变型等位基因与负调控的Sp1蛋白结合力较弱,因而表达更高,具有保护作用。
　　第二部分：
　　跨损伤DNA合成(Translesion DNA Synthesis,TLS),属于一种复制后修复过程,主要包括DNA聚合酶κ、η、ι、ζ等。跨损伤DNA合成途径是生物体的一种应急机制,能够在DNA损伤未被修复的状态下进行复制延伸。REV3L(hREV3)是DNA聚合酶的ζ的催化亚基,是跨损伤DNA合成途径的主要参与者。近年来研究表明REV3L基因能维持基因组稳定性,但也不可避免的会引起DNA突变。因而REV3L基因的多态有可能影响REV3L基因最终的表达量,从而影响肺癌的易感性。
　　为了检验这一假设,我们采用了病例一对照的研究方法,选择了该基因上的15个多态位点,对南京地区500例肺癌患者和517例正常对照进行了基因分型,研究不同等位基因型和基因型与肺癌风险的相关性;然后在来自上海地区的575例肺癌患者和589例对照人群中验证该多态和肺癌易感性的相关性。我们还进一步通过荧光素酶、表面等离子共振、细胞免疫荧光实验、克隆形成实验等方法深入的探索了阳性位点的功能。
　　在单位点分析中,我们发现REV3L基因上rs465646、rs459809和rs1002481三个多态位点的基因型分布在病例和对照中存在显著的统计学差异。其中3’UTR460T＞C(rs465646)多态位于3’UTR的一段保守区域中,其余两个SNP位于功能尚不清楚的内含子中。Rs465646多态的C等位型携带者显著降低肺癌发病风险(P=0.015)。我们在验证性关联分析中,我们发现rs465646多态的基因型分布在病例和对照中也存在显著的统计学差异(P＝0.049)。
　　生物信息学预测表明,REV3L基因3’UTR上有多个microRNA(miRNA)结合位点;T＞C多态会影响多个miRNA的结合。我们用表面等离子共振的方法,发现该多态位点附近与miR-25和miR-32均有结合。荧光素酶实验表明,共转染miR-25和miR-32均能显著降低含有REV3L基因3'UTR的报告基因的表达,表明上述miRNA能负调控REV3L基因的表达;此外,等离子表面共振实验表明,T等位型RNA与上述两种miRNA的结合能力更强。报告基因实验结果显示C等位型表达显著高于T等位型。烟草提取物能诱导REV3L基因表达,同时伴随着miR-32表达的显著降低,而miR-25表达没有显著变化;这表明miR-32可能在REV3L的转录后调控中起主要作用。REV3L基因的过表达能降低细胞的克隆形成,减少微核率,这表明REV3L基因具有稳定基因组、抑制肿瘤增殖的作用。我们转染两种等位型RNA来竞争内源miRNA,结果表明转染T等位型RNA后细胞克隆形成更少、微核率显著降低,这表明携带T等位型个体肿瘤基因组不稳定性增高、肿瘤发展更快。我们还在46对肺癌-癌旁组织中检测了REV3L基因的表达,结果表明REV3L基因mRNA在肺癌中表达显著低于癌旁。
　　本研究表明REV3L基因3'UTRrs465646多态为功能位点通过改变miRNA的结合,影响了基因的表达水平,从而使得携带两种基因型的个体肺癌发病风险不同。