索拉非尼对雷帕霉素诱导的肝细胞癌PI3K/AKT及MAPK信号通路异常活化的拮抗作用

摘要

原发性肝细胞肝癌是国内常见的恶性肿瘤之一。肝癌肝移植作为一种有效的治疗手段已在全球广泛开展,但是移植术后肿瘤的复发转移仍是限制患者长期存活的主要因素。找寻预防和治疗肝癌肝移植术后复发转移的有效手段将有助于提高肝癌肝移植的疗效。
　　近年来,多种分子靶向药物在临床肿瘤治疗中取得了良好效果。针对肝癌细胞中异常激活的,与其生长、增殖、侵袭以及血管生成等行为密切相关的信号通路,采用分子靶向药物的辅助治疗为肝癌肝移植术后复发转移的预防和治疗提供了新的可能。雷帕霉素作为一种免疫抑制剂已被有效的用于肝移植术后的抗排斥治疗,而其作为一种mTOR抑制剂,其抗肿瘤活性已被多个研究证实。但雷帕霉素的耐药问题,仍是限制其临床抗肿瘤应用的一大障碍。寻求其他治疗方式与雷帕霉素联合,从而使雷帕霉素具有的抗排斥及抗肿瘤的双重优势有机结合,将为肝癌肝移植术后肿瘤复发转移的预防提供良好的思路。索拉非尼是一种多激酶抑制剂,在抑制MAPK(Ras/Raf/MEK/ERK)通路的同时,还可抑制多种受体酪氨酸激酶的活性,达到良好的抗肿瘤效应,其安全性及有效性己被广泛认可。本研究立足于此,旨在探讨肝癌细胞对雷帕霉素耐药的机制以及联合应用索拉非尼对雷帕霉素耐药的拮抗。在本研究中首先观察到人肝癌细胞株对雷帕霉素单用存在的耐药现象;耐药现象的产生与雷帕霉素应用导致的P13K/AKT、MAPK信号通路的反馈激活密切相关;索拉非尼可有效的拮抗雷帕霉素导致的P13K/AKT、MAPK异常激活,增强对肝癌细胞生长的抑制;最后在一种潜在的大鼠原位肝癌肝移植模型中探讨雷帕霉素与索拉非尼的协同抗瘤作用。
　　第一部分，雷帕霉素对人肝癌细胞株生长增殖的影响
　　目的:观察雷帕霉素对人肝癌细胞株HepG2、HCC-LM3生长增殖的作用。
　　方法:应用MTT法检测雷帕霉素在不同药物浓度(0-100ng/ml)和不同作用时间(24h、48h、72h)下对HepG2、HCC-LM3肝癌细胞株生长增殖的抑制作用。
　　结果:雷帕霉素对HepG2及HCC-LM3细胞生长增殖存在抑制作用,且呈一定的时间和剂量依赖性;但雷帕霉素对肝癌细胞的抑制作用并不理想,即使较大剂量(100ng/ml)作用较长的时间(72h)其抑制率也在35％以下(HepG228.4％;HCC-LM334.1％)。
　　结论:雷帕霉素对肝癌细胞株生长的抑制作用并不理想,提示肝癌细胞对雷帕霉素存在耐药性。
　　第二部分，雷帕霉素对人肝癌细胞P13K/AKT和MAPK通路的激活
　　目的:探讨人肝癌细胞株对雷帕霉素耐药的机制。
　　方法:利用HepG2、HCC-LM3肝癌细胞株,分别予不同药物浓度的雷帕霉素处理2h或同一药物浓度(50ng/ml)处理不同的时间后提取蛋白,采用Westernblot方法观察phospho-AKTser473、phospho-p44/42MAPK(ERK1/2)(Thr202/Tyr204)和PDGFR-β的变化情况;采用P13K抑制剂LY294002预处理细胞后,观察雷帕霉素(50ng/ml,2h)作用对phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的影响;采用雷帕霉素(10ng/ml)作用24h后,提取RNA,qRT-PCR方法检测PDGFR-α、PDGFR-β的表达。
　　结果:雷帕霉素对HCC-LM3和HepG2细胞总AKT、总ERK表达无明显影响。雷帕霉素对肝癌细胞AKT的激活是一个快速反应并长时间持续的过程,并呈现明显的时间和剂量依赖性。较低剂量雷帕霉素作用短时间(10ng/ml,2h)对HCC-LM3和HepG2细胞ERK磷酸化水平的上调作用不明显,但当药物浓度提高或作用时间延长,ERK异常激活水平就明显上升,并呈现一定的剂量和时间相关性。P13K抑制剂LY294002的应用可引起肝癌细胞AKT及ERK活化水平的下调;采用LY294002预处理细胞后再给予雷帕霉素处理,未观察到磷酸化AKT水平的升高,但对肿瘤细胞ERK仍存在异常激活效应,但强度有下降。雷帕霉素在转录水平和蛋白翻译水平均上调了PDGFR-β在HCC-LM3和HepG2细胞中的表达,以对HepG2细胞PDGFR-β表达的上调最为明显。
　　结论:雷帕霉素呈时间与剂量依赖性异常激活AKT、ERK;AKT的异常激活呈P13K依赖性,而ERK的激活为P13K部分依赖;PDGFR-β的表达水平上调可能是雷帕霉素异常活化AKT和ERK的重要原因。
　　第三部分，索拉非尼对雷帕霉素激活的P13K/AKT和MAPK信号通路的抑制作用
　　目的:观察索拉非尼单用以及与雷帕霉素联合应用对肝癌细胞株生长增殖的抑制作用;探讨索拉非尼对雷帕霉素激活的P13K/AKT和MAPK信号通路的抑制作用及其机制。
　　方法:利用HepG2、HCC-LM3肝癌细胞株,应用MTT法观察索拉非尼在不同药物浓度(0-15μM)和不同作用时间(24h、48h、72h)下对生长增殖的抑制作用;应用MTT法,观察不同浓度的索拉非尼(0、2、5、10μM)与雷帕霉素(10ng/ml)联合作用在不同作用时间(24h、48h、72h)下对生长增殖的抑制作用;分别予不同药物浓度的索拉非尼单独处理细胞2h或同一药物浓度(5μM)处理不同的时间后提取蛋白,采用Westernblot方法观察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2和PDGFR-β的变化情况;雷帕霉素(50ng/ml)与不同浓度的索拉非尼联合作用2h,以及雷帕霉素(10ng/ml)与索拉非尼(5μM)联合作用不同时间,Westernblot方法观察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的变化情况。索拉非尼(5μM)单用,以及索拉非尼(5μM)+雷帕霉素(10ng/ml)作用细胞24h后,提取RNA,qRT-PCR方法检测PDGFR-β的表达。
　　结果:MTT实验结果显示,联合应用索拉非尼能明显增强雷帕霉素对HCC-LM3和HepG2生长增殖的抑制,且抑制作用的增强呈明显时间与剂量依赖性。通过Westemblot和RT-PCR结果显示,索拉非尼单用可呈剂量与时间依赖地抑制肝癌细胞ERK的活化,对AKT活化的也存在明显抑制效应,但抑制效应的剂量或时间依赖性较弱;联合应用索拉非尼在低浓度作用短时间(2μM,2h)时就能明显的抑制雷帕霉素导致的肿瘤细胞AKT、ERK异常的激活,并且其抑制效应呈明显的剂量与时间依赖性。索拉非尼单用可明显下调PDGFR-β在肿瘤细胞中的表达;联合应用索拉非尼明显下调了雷帕霉素导致的PDGFR-β在HCC-LM3和HepG2细胞中的过表达。
　　结论:联合应用索拉非尼后,可明显增强雷帕霉素对肿瘤细胞生长增殖的抑制作用。单独应用索拉非尼可抑制肝癌细胞AKT及ERK的活化。联合应用索拉非尼有效的抑制雷帕霉素导致的AKT及ERK的异常激活,这种抑制作用可能与索拉非尼对肝癌细胞PDGFR-β表达及活化的双重抑制密切相关。
　　第四部分，雷帕霉素及索拉非尼对大鼠肝细癌体外和体内作用的实验研究
　　目的:探讨雷帕霉素及索拉非尼对大鼠肝癌细胞株Morrishepatoma3924A(MH3924A)的体外作用及对大鼠原位肝癌模型的体内作用。
　　方法:应用MTT法观察索拉非尼、雷帕霉素单独及联合应用在不同药物浓度和不同作用时间对MH3924A大鼠肝癌细胞株生长增殖的体外抑制作用;分别予不同药物浓度的雷帕霉素、索拉非尼、雷帕霉素+索拉非尼处理2h或同一药物浓度处理不同的时间后提取蛋白,采用Westernblot方法观察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的变化情况;采用P13K抑制剂LY294002预处理细胞后,观察雷帕霉素(50ng/ml,2h)、索拉非尼(5μM,2h)、雷帕霉素(50ng/ml,2h)+索拉非尼(5μM,2h)应用对phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的影响;采用雷帕霉素(10ng/ml),索拉非尼(5μM),以及索拉非尼(5μM)+雷帕霉素(10ng/ml)分别作用细胞24h后,提取RNA,qRT-PCR方法检测。Pdgfr-α、Pdgfr-β的表达。建立ACI大鼠原位肝癌模型,将大鼠随机分为雷帕霉素组、索拉非尼组、联合用药组、对照组4组后分别处理;定期采用腹部彩超测量移植瘤体积并绘制肿瘤生长曲线;用药结束后,观察肿瘤生长及侵袭转移情况,HE染色比较各组肿瘤坏死程度,PCNA染色观察肿瘤细胞增殖情况;提取动物肿瘤蛋白,采用Westernblot方法观察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的变化情况。
　　结果:MTT实验结果显示,雷帕霉素对大鼠肝癌细胞株MH3924A生长增殖的抑制效果不理想;联合应用索拉非尼后明显增强了雷帕霉素对MH3924A生长增殖的抑制作用。通过Westernblot实验显示,雷帕霉素呈时间与剂量依赖性地上调MH3924A细胞AKT及ERK活化水平;采用LY294002预处理MH3924A细胞后再给予雷帕霉素处理,未观察到磷酸化AKT水平的升高,但对肿瘤细胞ERK仍存在异常激活效应,尽管强度有下降。单用索拉非尼对MH3924A细胞ERK的活化明显抑制,但对AKT抑制强度较弱,且无明显的剂量或时间依赖性;索拉非尼对雷帕霉素诱导异常活化的AKT和ERK的抑制作用明显,且存在时间与剂量依赖性。通过RT-PCR显示,雷帕霉素上调了MH3924A细胞Pdgfr-α和Pdgfr-β的表达;索拉非尼单用可明显下调Padgfr-β在MH3924A细胞中的表达,但对Pdgfr-α表达的下调作用不明显;联合应用索拉非尼明显下调了雷帕霉素导致的Pdgfr-β和Pdgfr-α在MH3924A细胞中的过表达。在大鼠原位肝癌模型中观察到,雷帕霉素或索拉非尼单独应用,对肿瘤的生长均有明显的抑制作用;但雷帕霉素单用对肿瘤肺转移、腹腔淋巴结转移等抑制作用并不明显。联合用药明显增强了对肿瘤生长及侵袭转移的抑制;联合用药组肿瘤坏死及肿瘤细胞的增殖抑制程度也显著强于单独用药组;雷帕霉素组肿瘤ERK和AKT的活化水平明显高于对照组;联合应用索拉非尼在体内也可明显下调雷帕霉素导致ERK和AKT的异常激活
　　结论:雷帕霉素与索拉非尼联合应用增强了对大鼠肝癌细胞株及原位肝癌模型的抗瘤作用;抗瘤作用的增强与索拉非尼对雷帕霉素导致的AKT和IMAPK活化的抑制密切相关。