大鼠前扣带皮层SIP30参与痛厌恶情绪反应的细胞分子机制

摘要

根据国际疼痛研究协会对于疼痛的定义，疼痛是一种与组织损伤或潜在的组织损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验，这一定义明确指出了疼痛的两个基本成分:感觉分辨和情绪体验。在临床上，疾病或创伤引起的外周或中枢神经系统损伤所致的神经病理性疼痛是最为常见的一类慢性痛。越来越多的临床观察表明，这些慢性痛患者除了忍受持续的、剧烈的疼痛外，在精神上也饱受折磨，出现的多种恶性情绪反应如恐惧、焦虑、孤独、厌世等严重地影响了患者的生活质量。考虑到目前对神经病理性痛以及痛相关厌恶情绪仍缺乏有效的治疗手段，寻找和发现治疗的新靶点变得更为迫切。
　　我们与合作实验室应用eDNA array、Northern blot、In situ等技术，对神经病理性疼痛的相关基因进行了筛选，基因差异表达的结果表明，sip30是与神经病理痛高度相关的基因之一。SIP30(SNAP25 interacting protein of30 kD)是于2002年首次在耳蜗毛细胞中发现的一种蛋白，它由266个氨基酸组成，由于可与SNAP25相互作用而得名。研究发现，SIP30广泛表达在神经系统，以脑内表达最为丰富。迄今为止，对SIP30的功能知之甚少。我们前期的研究结果表明，脊髓中的SIP30作为ERK-CREB信号通路的下游靶点，在神经损伤引起的痛觉敏化的发展和维持过程中起着重要的作用。
　　作为疼痛的重要组成部分，痛情绪和相关记忆的形成近年来受到了越来越多的关注。大量的研究结果表明，前扣带皮层(Anterior cingulate cortex，ACC)的激活与痛相关情绪反应以及对疼痛的认知、记忆和预期等过程密切相关。我们实验室前期的研究结果表明，ACC中NMDA受体依赖的cAMP/PKA-ERK-CREB信号通路的激活对于痛相关厌恶情绪的形成和表达是必需的。那么，高表达在ACC中的SIP30是否参与痛相关厌恶情绪形成？如果参与，是否是作为cAMP/PKA-ERK-CREB信号通路的下游的靶基因而发挥作用？SIP30又是如何参与痛相关厌恶情绪的形成？本研究围绕这一系列问题，采用行为训练、分子生物学、免疫组织化学以及离体脑片全细胞膜片钳记录等实验方法，首次系统的研究了ACC中SIP30在痛相关厌恶情绪中的作用及其可能的细胞分子机制。
　　应用免疫组织化学、Western Blot和行为训练等方法，我们观察了ACC中SIP30的表达与痛相关厌恶情绪之间的关系。结果表明，外周神经损伤（单侧坐骨神经慢性压迫损伤，CCI）能够引起大鼠双侧rACC（前扣带皮层吻侧部）中SIP30蛋白表达水平升高。上调的SIP30主要表达在ACC第Ⅱ-Ⅲ层锥体神经元中，在星型胶质细胞和小胶质细胞均未见SIP30表达。双侧ACC内预先微量注射以慢病毒为载体的针对SIP30的shRNA能够明显抑制慢性痛引起的明暗回避行为的形成，而不影响CCI引起的触诱发痛和热痛觉过敏以及非痛刺激引起的条件位置回避的形成，提示ACC中的SIP30特异性地参与了痛相关厌恶情绪的形成。
　　为了研究SIP30蛋白表达上调的上游调节通路，我们观察了PKA-ERK-CREB信号通路与SIP30之间的关系。免疫组织化学的结果显示，外周神经损伤引起双侧ACC中pPKA、pERK和pCREB表达上调，且SIP30与pERK和pCREB、pPKA与pERK和pCREB均有很好的共定位。双侧ACC内预先微量注射pPKA抑制剂Rp-cAMP或MEK（ERK激酶）抑制剂PD98059均能在抑制SIP30蛋白表达的同时，抑制慢性痛引起的明暗回避行为，而不影响CCI引起的触诱发痛和热痛觉过敏的形成以及痛觉敏化的程度。这一部分结果提示，PKA-ERK-CREB信号通路依赖的SIP30蛋白表达水平的升高是痛相关厌恶情绪形成所必需的。
　　前人免疫共沉淀和酵母双杂交的结果表明，SIP30与SNAP25存在直接的相互作用，SNAP25作为SNARE复合物的重要组成部分在神经递质释放过程中发挥作用。为进一步揭示SIP30介导痛厌恶情绪形成的可能机制，我们利用离体脑片全细胞膜片钳记录和在体微透析结合高效液相色谱(HPLC)的方法观察了SIP30对兴奋性突触传递的影响。电生理记录显示，电刺激诱发的ACC神经元的兴奋性突触后电流(EPSC)结果显示，在SIP30 shRNA组明显降于阴性对照(negative control，NC)组，提示ACC中SIP30沉默抑制了兴奋性突触传递。自发的兴奋性突触后电流(sEPSC)无论是频率还是幅度在SIP30 shRNA组都显著降低，配对脉冲比(PPR)进一步证实SIP30 shRNA组在不同时间间隔的PPR均较NC组明显升高，提示SIP30沉默不仅抑制了兴奋性突触传递，也抑制了突触前兴奋性神经递质的释放。在体微透析结合HPLC的结果显示，双侧ACC给予SIP30 shRNA后，细胞外的谷氨酸浓度显著降低，提示SIP30基因沉默抑制了谷氨酸的释放。
　　在大鼠ACC脑片上，Theta波刺激(theta burst stimulation，TBS)能够稳定诱导出长时程增强(long-term potentiation，LTP)。SIP30基因沉默完全阻断LTP的产生，提示SIP30对ACC神经元突触可塑性的形成具有重要意义。
　　综上所述，ACC中PKA-ERK-CREB信号通路的激活引起SIP30蛋白表达水平的升高，进而影响Glu的释放和突触可塑性改变，这可能是SIP30介导痛相关厌恶情绪形成的细胞机制。

目录

缩略词表

摘要

1．前言

2．材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 试剂和药品

2．1．3 实验仪器及工具软件

2．2 实验方法

2．2．1 行为学实验

2．2．2 慢病毒为载体SIP30 shRNA制备及筛选过程

2．2．3 ACC埋管及微量注射

2．2．3 皮层神经元原代培养

2．2．4 免疫荧光化学实验

2．2．5 Western blot

2．2．6 微透析及HPLC实验

2．2．7 电生理实验

3．实验结果

3．1 ACC中SIP30蛋白表达上调是痛相关厌恶情绪产生的必要条件

3．1．1 坐骨神经慢性压迫损伤引起明暗回避反应

3．1．2 外周神经损伤引起ACC脑区SIP30蛋白表达水平的升高

3．1．3 SIP30在ACC脑区分布的细胞亚型

3．1．4 ACC脑区SIP30基因沉默阻断痛厌恶情绪的形成

3．2 PKA-ERK-CREB信号通路的撤活参与SIP30蛋白表达水平的上调

3．2．1 外周神经损伤引起ACC内PKA-ERK-CREB信号通路的澈活进而导致SIP30蛋白表达水平上调

3．2．2 阻断ACC内PKA、ERK的激活通过抑制SIP30蛋白表达水平的上调而阻断痛相关厌恶情绪的产生

3．2．3 阻断ACC内PKA、ERK的澈活不影响CCI导致的痛觉敏化现象

3．3 SIP30影响兴奋性突触传递效能

3．3．1 SIP30在细胞类型和亚细胞结构的分布

3．3．2 ACC脑区SIP30基因沉默对兴奋性神经递质释放的影响

3．3．3 ACC脑区SIP30基因沉默对兴奋性突触传递效能的影响

3．4 SIP30基因沉默阻断ACC神经元长时程增强(LTP)的产生

3．4．1 大鼠ACC脑片上能够诱导出稳定的长时程增强

3．4．2 SIP30参与ACC脑片LTP的产生

4．讨论

4．1 SIP30在神经系统的分布

4．2 SIP30在疼痛中的作用

4．3 SIP30与PKA-ERK-CREB信号通路的关系

4．4 SIP30与神经递质释放的关系

4．5 SIP30与突触可塑性的关系

5．总结

参考文献

综述 前扣带皮层与痛相关厌恶情绪

博士期间已发表文章

博士期间待发表的文章

获得资助

获奖情况

参加学术交流

博士期间参与的其他课题

致谢

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