复合神经动作电位对损伤神经的定量研究

摘要

第一部分、在体大鼠正中神经复合神经动作电位的记录方法和电极间距选择
　　 目的：本研究的目的是研究大鼠正中神经复合神经动作电位在体记录的方法和电极距离参数。
　　 方法：用不同的方法在短的大鼠正中神经干上记录CNAP，观察复合神经动作电位的各参数变化，找出一种既可行又稳定的CNAP记录方法，然后顺行或逆行记录CNAP，比较这两种记录方法的差异，最后改变记录CNAP的不同电极之间间距(三种距离)，包括在刺激电极两针之间，记录电极两针之间，记录和刺激电极之间，分别从1mm、2mm、3mm、4mm、5mm，观察刺激电极间距、记录电极间距、刺激到记录电极间距分别对CNAP的影响。
　　 结果：如果完全游离整个神经干，刺激、记录电极分别置于两端，地线不管置于神经干上、附近筋膜组织、还是无地线，均不能记录到CNAP。但仅游离神经干远端和近段，中间约5mm左右的一段未游离，地线置于中间未游离组织系膜附近组织，就可以恒定地记录到CNAP。逆向记录的CNAP，为三相波，虽刺激强度较小(包括阈刺激和超大刺激强度)，但基线不平，干扰大，不易于精确测量；顺向记录的CNAP，为双相波，波形较稳定，虽刺激强度较大(包括阈刺激和超大刺激强度)，但干扰小，易于精确测量。当刺激电极两针之间的距离从1.0毫米到5.0毫米改变时，记录到的CNAP的刺激阈值和超强刺激强度逐渐减低(P<0.01)。当记录电极两针之间的距离从1.0毫米到5.0毫米改变，记录到的CNAP幅度逐渐增加(P<0.01)。当记录和刺激位置之间的距离(8毫米，10毫米，12毫米)改变时，记录到的CNAP各参数没有显著变化(P>0.05)。
　　 结论：大鼠正中神经上臂部，两端游离，中间保留系膜，不游离，地线插入刺激与记录之间的系膜附近，能恒定记录到CNAP；刺激电极与记录电极最佳间距均为5.0mm，刺激电极到记录电极之间最佳距离为10mm；顺向记录的CNAP波形较为稳定，干扰小，易于测量，优于逆向记录。
　　 第二部分、大鼠正中神经再生不同时段电生理(CNAP、CMAP)、功能、形态学、分子生物学特点及他们之间的相关性分析
　　 实验一：大鼠正中神经再生不同时段电生理(CNAP、CMAP)、功能、形态学特点及他们之间的相关性分析
　　 目的：探讨大鼠正中神经切断吻合后的不同时段电生理(CNAP、CMAP)、功能与形态学方面的特点及他们之间的相关性分析。
　　 方法：大鼠上臂正中神经中段切断缝合后的不同的时间点(从2-12w)，进行抓握力测试，然后游离正中神经进行CNAP、CMAP检测，最后切取正中神经缝合口远端、近端和正常侧神经组织分别标记固定进行电镜半薄切片甲苯胺蓝染色和超薄切片饿酸染色，分别行光镜和电镜超微结构观察，获取有髓纤维计数、髓鞘厚度等各种形态学参数。获取指浅屈肌标本，称湿重后，甲醛固定，行肌肉HE染色，观察形态学变化。对CNAP的波幅和有髓神经纤维计数进行相关性分析；对CMAP的波幅和抓握力进行相关性分析。
　　 结果：术后第2w，可以记录到CNAP。术后2，3，4，6，8和12周，再生神经记录的CNAP幅度，峰-峰幅度(PPA)，与正常的CNAP相比，有显著差异(P<0.01)。波幅下面积(Area)也显著低于正常(P<0.01)。2周到6周的潜伏期(Lat)均比正常明显延长(P<0.05)。传导速度(CV)显著慢于正常对照(P<0.01)。2周到8周刺激强度(阈强度THI和超大刺激强度SSI)显著低于正常对照。术后第2、3w记录的CNAP波幅比术后第6、8、12w明显降低。术后第6w后，CNAP波幅开始倾向于稳定，CNAP波幅恢复率也接近第8w和12w。术后2周，实验侧仅有1只大鼠，记录到CMAP小于0.5mV的波幅(Amp)和大于12ms的潜伏期(Lat)，其余5只均未记录到CMAP。术后2-8周：实验侧的CMAP的波幅和波形下面积(Area)比对照侧显著减少(P<0.01)；损伤神经的前肢抓握力：术后2周，均为0g；术后3周，除一个样本(12±4g)，其余均为0g。再生神经前肢抓握力的恢复率统计分析。术后第2，3，4和6周，再生神经的前肢抓握力与健侧有显著差异(P<0.01)。神经修复后2w吻合口远端已有少量的新生轴突，随着再生时间延长，越来越多的再生轴突延伸至远端。正常正中神经的CNAP波幅和有髓纤维的计数的线性回归分析，CNAP波幅和有髓纤维的计数之间有强的正相关，其相关系数0.98。而对于不同时段再生的正中神经的CNAP波幅和有髓纤维计数散点图显示没有线性关系趋势，相关分析显示相关系数为0.39。而每个再生时段，有线性趋势，切断缝合后每个时段的6个样本经线性回归分析，均有线性关系，斜率较为接近，相关系数都在0.92以上，相关系数平方在0.81以上。CMAP波幅和抓握力进行非线性回归分析，并行hyperbolic曲线拟合，结果表明他们之间存在强的正相关，相关系数为r2为0.959值。
　　 结论：对早期的神经功能评价，CNAP优于CMAP；在术后不同时段，CNAP波幅与有髓纤维计数之间有弱的相关性，但在每一时段，他们之间有线性关系，各个时段的线性斜率相近，截距不同；在正常正中神经，CNAP波幅与有髓纤维计数之间有线性关系；在术后不同时段，CMAP波幅与抓握力有强的正相关。
　　 实验二：大鼠正中神经再生不同时段电生理(CNAP)、分子生物学特点及他们之间的相关性分析
　　 目的：研究大鼠正中神经损伤修复不同时段分子生物学因素GAP43、MPZ、NF-L的mRNA和蛋白水平表达变化及其与电生理参数的相关性。
　　 方法：大鼠上臂正中神经中段切断缝合的不同的时间点(从2-12w)，进行CNAP检测，随后取6个实验组缝合口远端正中神经和正常对照组的正中神经组织液氮冷冻保存，用实时定量PCR和Westernblot方法检测GAP43、MPZ、NF-L的mRNA和蛋白水平表达变化，最后统计分析CNAP参数与分子指标的相关性。
　　 结果：术后第2w开始，可以记录到CNAP。术后2，3，4，6，8和12w，再生神经记录的CNAP波幅，包括第一峰波幅(FPA)和峰-峰波幅(PPA)，与正常的CNAP相比，有显著差异(P<0.01)。波幅面积(Area)也显著低于正常(P<0.01)。传导速度(CV)显著慢于正常对照(P<0.01)。从术后2到4周，潜伏期(Lat)均比正常明显延长(P<0.01)。从术后2到8周，刺激强度(阈强度THI和超大刺激强度SSI)显著低于正常对照(P<0.01)。神经切断缝合后2w到6w GAP43的mRNA和蛋白水平表达与对照组比较明显上调(P<0.01)，8周后开始表达渐渐降低，但12w仍高于正常。切断缝合后2w至6w，MPZ、NF-L的mRNA表达与对照组比较明显下调(P<0.01)，8周、12w后表达增加稍高于正常。切断缝合后2w至3w，MPZ、NF-L的蛋白表达与对照组比较明显下调(P<0.01)，6周接近正常，8w、12w表达增加稍高于正常。远端记录的CNAP波幅与MPZ、NF-L的mRNA和蛋白水平表达有正相关(相关系数为0.615)，与GAP43mRNA和蛋白水平表达有负相关(相关系数为0.553)。
　　 结论：大鼠正中神经损伤远端的分子指标，MPZ、NF-L早期表达低，尔后渐升高，相反，GAP43早期表达很高，之后渐下降。CNAP波幅与其MPZ、NF-L的表达水平表达成正相关，与其GAP43表达水平表达成负相关。
　　 第三部分、复合神经干动作电位与再生神经纤维数目之间的相关性研究
　　 目的：大鼠正中神经切断缝合后神经再生期间，其复合神经动作电位(CNAP)与神经再生纤维数目之间的相关性研究。
　　 方法：大鼠上臂正中神经中段切断后，用6种不同型号的缝线进行缝合，切断缝合后的2w和8w，进行CNAP检测，观察其参数变化，然后切取大鼠正中神经组织标本(正常、缝合口近端、缝合口远端)，用半薄切片甲苯胺蓝染色、免疫组化、luxol fast blue染色三种形态学检测方法进行有髓神经纤维计数，然后用线性回归方法，分析他们之间相关性。
　　 结果：神经切断缝合术后2w和8w，再生神经记录的CNAP波幅，包括第一峰波幅(FPA)和峰-峰波幅(PPA)，与正常的CNAP相比，有显著差异(P<0.01)。波幅面积(Area)也显著低于正常(P<0.01)。三种方法的再生神经远端形态学观察，术后2周，可见许多不完整，破裂的髓鞘，有大量变性的轴突，可见巨噬细胞吞噬髓鞘碎屑的现象；有少量、小的、新生薄髓鞘轴突，薄髓鞘轴突不均匀分布，结构相对紊乱；术后8周，小的、新生的薄髓鞘轴突明显增多，有髓轴突比切断缝合术后2周直径明显增大，仅偶尔可见一些不完整，破裂的髓鞘，很少见巨噬细胞吞噬髓鞘碎屑的现象，薄髓鞘轴突分布不均匀，结构比切断缝合术后2周相对排列集中，但仍比正常轴突排列散乱，成族成群的小直径新生轴突居多。在切断缝合术后2w，延伸到缝合口远端的有髓纤维的总数约为正常的20％左右，在切断缝合术后8w，延伸到缝合口远端的有髓纤维的总计数大于正常。在切断缝合术后2w和8w，不同型号缝线的各组之间的正中神经有髓纤维再生恢复率之间都有明显统计学差异(P<0.05)。线性回归分析，远端记录的CNAP波幅与其有髓神经纤维计数之间有强的正相关(三种方法的相关系数均在0.740以上)。CNAP波幅和有髓纤维的计数之间有强的正相关，并有线性关系。直线拟合构建的线性方程式为：切断缝合术后2周，有髓纤维计数(y)=波幅(x)K+B，K(190.89-289.81)，B(-256.00-122.53)；切断缝合术后8周，y=Kx+B，K(224.39-305.57)，B(2539.47-2750.12)。应用2w的方程y=Kx+B，验证第二部分实验2w的波幅和有髓纤维计数的有效率为95.8％；应用8w的方程y=Kx+B，验证第二部分实验8w的波幅和有髓纤维计数的有效率为96.4％。实验结果表明，所得出的线性方程，有较高的符合率。
　　 结论：大鼠正中神经切断缝合后早期和成熟期，再生神经的远端的CNAP波幅与相应位置的有髓纤维计数之间均有线性关系；拟合的线性方程斜率的相近，仅截距有明显差异，线性方程验证有较高的符合率，可以在神经损伤后再生早期或晚期，根据电生理CNAP的波幅，通过线性方程计算出损伤远端的有髓纤维计数，确定神经再生的轴索通畅率，定量评定损伤神经的功能。