Tbx1基因表达调节斑马鱼神经嵴细胞的发育及其与视黄酸信号的关系

摘要

DiGeorge综合征(DGS)是人类最常见的染色体缺失综合征之一，活产婴儿发病率约1/4000-5000。由于DGS累及组织器官较多，对患者的危害较大，特别是复杂心血管畸形，严重影响患者的生活质量和生命安全。因此，研究DGS的发病机理，探索预防策略十分重要。
　　近年来研究表明，DGS的发生与tbx1基因单倍剂量不足(haploinsufficiency)、神经嵴细胞(Neural crest cells，NCCs)发育异常等多种因素有关。鉴于此，我们研究了两者之间的关系。NCCs中tbx1基因不表达，可能存在介导tbx1基因作用的因子。
　　视黄酸(Retinoic acid，RA)是胚胎发育过程中必需的微量营养素，也是一种作用广泛的信号分子，与心脏发育的多个阶段有关。动物实验证实，RA缺乏会造成心血管系统发育异常，与DGS特征相似。
　　为此，我们考虑RA是否为tbx1基因表达与NCCs发育之间的“桥梁”？我们以斑马鱼为模式生物，研究了tbx1基因表达对NCCs发育的影响，并探讨RA在其中所起的作用。
　　为了模拟DGS患者tbx1基因单倍剂量不足，在第一部分，我们首先构建了tbx1基因表达下调的斑马鱼模型。通过显微注射特异性的tbx1基因反义寡核苷酸tbx1-MO，下调tbx1基因表达，导致斑马鱼表型异常，表现为心脏环化障碍、心包水肿、下颌骨减小、耳囊减小、眼睛减小。通过tbx1-MO效率验证，证实tbx1基因表达下调成功。
　　在tbx1基因表达下调的模型中，我们研究NCCs的发育过程。选取NCCs不同发育阶段的标记基因，通过胚胎整体原位杂交的方法，发现NCCs的起始、剥离、迁移、分化等多个发育环节都受到了tbx1基因表达下调的影响，发育过程受到抑制，心脏神经嵴细胞(Cardiac neural crest cells，CNCCs)向心脏细胞的分化障碍。
　　在第二部分，我们构建了RA缺乏的斑马鱼模型。通过显微注射视黄醛脱氢酶基因(raldh2)的反义寡核苷酸，下调raldh2基因表达，并通过效率验证，证实raldh2基因表达下调成功。Raldh2基因表达下调的斑马鱼，表型异常，表现为心脏环化障碍，心包水肿、体长短。而且我们发现，NCCs的起始、剥离、迁移与分化过程也受到了抑制，CNCCs向心脏细胞分化障碍。
　　鉴于tbx1基因表达下调与raldh2基因表达下调，NCCs发育抑制的表现非常相似，在第三部分，我们研究了tbx1基因表达与RA信号分子之间的关系。
　　通过原位杂交和real-time PCR的检测，我们发现，tbx1基因表达下调的斑马鱼中，RA合成酶基因-raldh2表达降低，而RA降解酶基因-cyp26a1，cyp26b1，cyp26c1表达增强，说明tbx1基因表达下调可以从合成和降解两方面降低斑马鱼体内RA的水平。
　　我们在体外人工合成斑马鱼raldh2 mRNA，对tbx1基因表达下调的斑马鱼进行拯救。实验证明，外源raldh2基因可以拯救tbx1基因表达下调的结果，异常的斑马鱼表型以及NCCs标记基因的表达都大部分得到拯救。因此，我们得出结论，RA是介导tbx1基因对NCCs发育调节的“中间桥梁”，tbx1基因表达通过RA来调节NCCs的发育。

目录

英文缩略词表

摘要

引言

第一部分 斑马鱼tbx1基因表达下调模型的构建及tbx1基因表达下调对神经嵴细胞发育的影响

第一节 斑马鱼tbx1基因表达下调模型的构建

第二节 斑马鱼tbx1基因表达下调对神经嵴细胞发育的影响

第二部分 斑马鱼视黄酸缺乏模型的构建及视黄酸缺乏对斑马鱼神经嵴细胞发育的影响

第一节 斑马鱼RA缺乏模型的构建

第二节 raldh2基因表达下调对斑马鱼神经嵴细胞发育的影响

第三部分 RA在tbx1基因表达调节斑马鱼神经嵴细胞发育中的作用

第一节 tbx1基因表达与RA代谢酶基因表达的关系研究

第二节 RA拯救tbx1基因表达下调的斑马鱼畸形及NCCs的异常发育

全文总结

创新性与局限性

未来展望

参考文献

心脏神经嵴细胞与心脏发育的关系

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