TtATG8基因在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)自噬发生中的功能研究

摘要

自噬是细胞内主要用于降解大分子蛋白质或受损伤的细胞器如细胞核和线粒体等，以此来维持细胞动态平衡的代谢途径。尽管自噬相关基因(ATG)相继在酵母，植物及哺乳动物细胞中被发现，但其在单细胞真核原生动物四膜虫（Tetrahymena）中的同源基因尚未被鉴定。本研究首次克隆发现了四膜虫的自噬相关基因TtATG8，该基因所编码的蛋白质序列与酵母ATG8和人LC3基因的蛋白质序列具有很高的同源性。我们的研究发现雷帕霉素（Rapamycin）处理可导致TtATG8表达的增加;同时在荧光显微镜下可观察到EGFP-TtATG8绿色荧光信号增强，结果提示TtATG8可作为衡量四膜虫自噬水平的良好指标。我们的研究还发现饥饿处理可诱导增强自噬的发生，TtATG8表达水平并随后增加细胞死亡率;雷帕霉素预处理可放大饥饿条件下的细胞中TtATG8的转录水平，同时通过增强自噬作用和防止ATP的消耗来增加细胞存活率。另外，我们的研究结果提示TtATG8过表达可促进细胞内ATP的积累并延长细胞生存期。综上所述，我们的研究首次揭示了TtATG8基因可能参与四膜虫自噬的调控过程，其表达水平的改变可能影响细胞的生存期。

目录

摘要

引言

1．自噬——从形态学研究到分子机制初探

2．四膜虫的研究进展

3．以四膜虫为模式生物的自噬相关研究

材料

1．四膜虫细胞

2．菌株和质粒

3．培养基和主要试剂

4．常用储存液及缓冲液

5．仪器设备

6．引物合成

方法

1．细胞培养

1．1 细胞保存与培养

1．2 嗜热四膜虫细胞接合生殖培养

2．细胞处理

2．1 过氧化氢处理

2．2 雷帕霉素处理

2．3 营养饥饿处理

3．细胞学分析

3．1 细胞染色和激光共聚焦显微分析

3．2 细胞活性检测

3．3 细胞内总ATP检测

3．4 流式细胞仪检测细胞死亡

4．RT-PCR

5．蛋白质免疫印迹分析

6．基因克隆及质粒构建

6．1 TtATG8基因克隆

6．2 EGFP-TtATG8质粒构建

6．3 pD5H8-EGFP-TtATG8和pD5H8-TtATG8转化质粒构建

6．4 基因敲除质粒MTT1-TtATG8构建

7．TtATG8片段的蛋白质表达纯化

8．嗜热四膜虫的基因枪接合生殖转化和筛选

9．照片处理与统计学分析方法

结果

1．TtATG8基因克隆

2．载体构建与转化子鉴定

2．1 重组质粒pD5H8-TtATG8和pD5H8-EGFP-TtATG8转化子的鉴定

2．2 重组质粒MTT1-TtATG8的构建

3．TtATG8基因参与Tetrahymena thermophila细胞的自噬调控

3．1 雷帕霉素诱导自噬并增加TtATG8的表达

3．2 氧化刺激诱导自噬引起TtATG8表达水平上调

3．3 营养饥饿诱导自噬增加TtATG8的表达

4．过度表达TtATG8基因促进Tetrahymena thermophila细胞生存

4．1 雷帕霉素预处理可以防止饥饿引起的细胞死亡和ATP过度消耗

4．2 TtATG8基因过表达延长嗜热四膜虫细胞生存期

讨论

1．细胞自噬的调控机制

2．TtATG8基因与嗜热四膜虫细胞自噬的关系

3．TtATG8基因与嗜热四膜虫细胞存活的关系

4．嗜热四膜虫转基因方法和基因调控研究

参考文献

发表文章

致谢

附件文献综述 细胞自噬与细胞死亡机制的研究

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