肝细胞癌基因组后由数畸变区域内相关基因的功能及分子机理研究

摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，占全球癌症相关死亡的第三位，其高发地区主要位于东亚(包括蒙古)、东南亚以及撒哈拉以南非洲地区。然而关于这一致命性疾病的发病机制仍不十分清楚，其发生、发展的分子机理亟待阐明。目前，一种用来发掘肿瘤相关基因的有效方法是在频繁发生异常改变的基因组区域中寻找潜在的候选基因。通过以往的研究，在肝癌基因组中已发现一些常见的拷贝数畸变(Copy number alteration，CNA)区域，然而它们大多应用较低分辨率的研究技术，因此仅提供了一个较为局限的肝癌基因组拷贝数畸变概貌。为解决这一问题，本研究首先应用最新的Affymetrix single nucleotidepolymorphism6.0(SNP6.0)芯片分析58对肝癌原发灶及癌旁肝组织的DNA拷贝数改变，发现1，241个拷贝数畸变(CNA)区域，包括963个扩增区和278个缺失区。随后，通过整合性分析拷贝数畸变与基因表达谱数据，获得362个位于拷贝数畸变区域中的差异表达基因，并对这362个基因进行基因功能(Gene ontology，GO)及相互作用网络(Network)分析，一方面发现了一些关键生物学过程和信号通路在肝癌中发生异常改变，另一方面获得了一些位于相互作用网络中关键节点的基因，为筛选候选基因进行功能研究提供了依据。通过系列体内外功能实验检测20个候选基因对肝癌细胞增殖能力的影响，发现1个新的候选抑癌基因TRIM35(tripartite motif-containing35)和2个新的候选癌基因HEY1(hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif1)与SNRPE(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide E)。进一步研究发现TRIM35基因通过阻滞细胞周期于G2/M期和促进细胞凋亡而发挥其抑制肝癌细胞增殖的作用。此外，通过免疫组化实验发现TRIM35基因在肝癌组织中蛋白表达水平与肝癌的组织学分级、肿瘤大小以及血清AFP水平等临床病理学指标呈负相关。最后，通过对肝癌基因组中新发现的拷贝数扩增位点1q24.1-24.2进行深入研究，发现一个新的肝癌转移促进基因MPZL1(myelin proteinzero-like l)，其表达水平与肝癌的组织学分级和肝内转移等临床病理学指标呈正相关。进一步研究发现MPZL1基因能够通过诱导Cortactin蛋白的磷酸化水平增加与激活而发挥其促转移功能，且这一信号传导过程依赖Src蛋白激酶活性。综上所述，这些研究结果表明整合性分析拷贝数畸变与表达谱数据能够有效地发掘新的肿瘤相关基因，为肝癌发病机制的阐明提供了新的理论依据。
　　 第一部分肝细胞癌基因组拷贝数畸变全景分析
　　 过往研究在肝癌中已鉴定出一些常见的CNA，但它们主要采用相对较低分辨率的检测技术，从而只能提供一个较为局限的肝癌基因组拷贝数畸变概况。为此，本研究拟采用人全基因组SNP6.0芯片来检测肝癌全基因组拷贝数畸变图谱。通过应用高分辨率SNP6.0芯片检测58例肝癌原发灶及癌旁肝组织DNA、利用Partek软件包对芯片原始数据进行挖掘并分析拷贝数畸变情况、参考UCSC hg18版本基因组序列对CNA进行基因组定位分析以及运用统计学方法筛选出肝癌基因组中具有显著意义的CNA位点，最终在肝癌基因组中共发现1，241个显著CNA位点，包括963个扩增和278个缺失位点。这些位点中部分与以往在肝癌中发现的CNA位点高度相符，例如8q，1q，7q，6p，17q和20q等位点的扩增以及8p，4q，16q和17p等位点的缺失。此外，在肝癌基因组中还发现很多新的CNA位点，包括1p，2q，3q，6q，8p，9p，10p，13q，18p，19p和22q等扩增位点及3q，4p，8q，12p，14q和18q等缺失位点。本研究为进一步寻找肝癌基因组拷贝数畸变区域内候选肿瘤相关基因奠定了基础。
　　 第二部分肝细胞癌拷贝数畸变区域内相关基因的生物信息学分析
　　 高通量基因组检测技术可以对数以千计的肿瘤样本基因组进行分析，然而如何从产生的海量数据中筛选出真正的肿瘤相关基因将是一个巨大的挑战。为筛选肝癌基因组中拷贝数畸变相关基因，本研究首先对肝癌基因组拷贝数畸变与转录组差异表达谱数据进行整合性分析，获得了362个位于拷贝数畸变区域中的差异表达基因，包括292个位于扩增区域中的上调基因和70个位于缺失区域中的下调基因，并进一步采用生物信息学分析方法对这362个基因进行GO及Network分析，一方面可以发现肝癌发生、发展过程中一些核心的生物学过程发生异常改变，包括DNA复制/mRNA加工，细胞周期/细胞增殖，蛋白质运输/蛋白质折叠，细胞粘附/细胞运动等；另一方面可以发现很多生物学过程和信号通路之间通过一些关键基因相互联系，例如GNAO1、GNAZ、PLCB1、CDC25B、LAMC1、FOS、ETS1和SHC1等。最终，通过上述综合性分析结合文献查询，我们挑选出20个候选基因准备进行后续功能分析，并通过定量PCR技术验证其在肝癌组织中表达水平。综上所述，通过整合性分析及联合生物信息学分析能够有效地从冗长的基因列表中挑选出候选基因，为后续肿瘤相关基因的鉴定及分子机理研究奠定基础。
　　 第三部分缺失区域内候选抑癌基因TRIM35的功能及初步机理研究
　　 前两部分的研究共获得20个候选基因，为进一步确定它们在肝癌发生过程中所发挥的作用，本研究拟对这20个基因的生物学功能和初步机理进行分析。首先构建了20个基因的慢病毒表达载体并分别建立稳定表达肝癌细胞株，随后通过各种体内外实验检测20个基因对肝癌细胞增殖能力的影响，发现1个新的候选抑癌基因(TRIM35)和2个新的候选癌基因(HEY1和SNRPE)。进一步通过对细胞周期和细胞凋亡的分析，发现TRIM35基因一方面通过将细胞周期阻滞于G2/M期，另一方面通过促进细胞凋亡，从而抑制肝癌细胞的增殖。最后，通过免疫组化实验检测了207对肝癌组织及相应癌旁肝组织中TRIM35蛋白表达水平，并将其与多项临床病理学指标进行相关性分析，发现TRIM35蛋白水平与肝癌的组织学分期、肿瘤大小及血清AFP水平等三项临床病理学指标呈负相关。
　　 第四部分扩增区域内MPZL1基因在肝细胞癌转移中的作用及机理研究
　　 本研究通过整合性分析拷贝数畸变与基因表达谱数据，以及利用系列体内外功能性实验，发现肝癌基因组中1q24.1-24.2位点的频繁拷贝数扩增能够引起MPZL1基因表达水平的上调，进而导致肝癌细胞转移能力的增强。而且MPZL1基因表达水平的增加与肝癌的组织学分级及肝内转移等临床病理学指标呈正相关。进一步研究发现MPZL1基因增强肝癌细胞转移能力的机制之一可能为导致Cortactin蛋白的磷酸化水平增加。Cortactin为一种细胞内广泛分布的肌动蛋白结合蛋白，在多种肿瘤组织中表达水平上调且能够促进肿瘤的恶性进展与转移。此外，通过应用Src激酶小分子抑制剂与显性负突变体(Donunant negative mutant)，发现Src蛋白激酶能够介导MPZL1基因过表达引起的Cortactin蛋白的磷酸化水平增加与激活。综上所述，这些结果表明在肝癌基因组拷贝数扩增区域lq24.1-24.2中存在一个潜在的肝癌转移促进基因MPZL1，其通过促进Src激酶磷酸化水平增加，进而磷酸化并激活Cortactin蛋白，从而促进肝癌细胞转移。