单抗CD44-生物素-亲和素绑定技术用于软骨组织工程的效果研究

摘要

第一部分
　　 单抗CD44-生物素-亲和素绑定技术
　　 提高软骨细胞与壳聚糖无孔膜黏附力的实验研究
　　 目的：考察单抗CD44-生物素(Biotin)-亲和素(Avidin)绑定技术(CBA技术)能否在构建的软骨细胞二维培养体系中提高软骨细胞与壳聚糖无孔膜表面的黏附能力。
　　 方法：软骨细胞分离培养及鉴定，制备壳聚糖无孔膜。制备软骨细胞二维培养体系，分3组：A.壳聚糖无孔膜+软骨细胞(常规组)；B.生物素+亲和素化壳聚糖无孔膜+软骨细胞(BA技术组)；C.生物素化单抗CD44+亲和素化壳聚糖无孔膜+软骨细胞(CBA技术组)。分别在细胞种植后的1h、2h、4h、12 h和24 h，用相差显微镜对细胞的生长黏附情况进行照相分析，并利用图像软件对各组细胞的展平面积测定并统计，分析软骨细胞对壳聚糖无孔膜表面的黏附能力。
　　 结果：C组的大部分细胞在接种后1h就已经张开并展平，而B组和A组细胞则分别需要2h和12 h才能达到大致相同的形状。C组细胞的展平面积明显大于B组和A组。接种后4h，25％的C组细胞的面积达到1500-2000μm2，而B组同期只有15％，A组则要到24 h后才能达到15％。各组展平面积随时间延长递增，各时间点平均展平面积C组>B组>A组，各组差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 结论：Biotin-Avidin绑定技术能比常规接种方法提高软骨细胞与壳聚糖无孔膜黏附能力，但是相比而言，单抗CD44-Biotin-Avidin绑定技术对于软骨细胞粘附能力的提高更加显著。
　　 第二部分
　　 单抗CD44-生物素-亲和素绑定技术
　　 提高软骨细胞与壳聚糖三维支架黏附力及体外构建组织工程软骨的实验研究
　　 目的：观察单抗CD44-生物素(Biotin)-亲和素(Avidin)绑定技术在构建的软骨细胞三维培养体系中能否提高软骨细胞与壳聚糖支架的黏附能力，在体外构建的组织工程软骨(Tissue engineering cartilage，TEC)能否促进软骨细胞的增殖和软骨细胞表型的表达。
　　 方法：制备软骨细胞三维培养体系，分3组：A.壳聚糖三维支架+软骨细胞(常规组)；B.生物素+亲和素化壳聚糖三维支架+软骨细胞(BA技术组)；C.生物素化单抗CD44+亲和素化壳聚糖三维支架+软骨细胞(CBA技术组)。软骨细胞接种后分别用细胞计数仪计数脱落细胞，测定接种细胞脱落率；MTT法生长曲线测定壳聚糖支架内软骨细胞增殖率；扫描电镜观察细胞支架复合体上细胞生长情况；生物化学检测TEC内的DNA和GAG含量；组织学切片观察TEC内软骨细胞的增殖和胞外基质的表达情况；RT-PCR法检测Ⅱ型胶原(ColⅡ)、aggrecan、sox9的mRNA表达。
　　 结果：细胞接种脱落率：A组为C组的3.71倍，为B组的2.17倍，而B组为C组的1.71倍，A组>B组>C组(P<0.05)。扫描电镜见C组细胞数量较多，成分散状，分布较均匀；A组细胞数量很少，成聚集状，分布很不均匀；B组所见介于C与A组间。组织切片显示细胞在支架内C组增殖旺盛，胞外基质表达较丰富；A组增殖较弱，胞外基质表达较弱；B组介于C与A组间。DNA和GAG含量，细胞增殖率及ColⅡ、aggrecan、sox9的mRNA表达量表现为：C组>B组>A组(P<0.05)。
　　 结论：单抗CD44-Biotin-Avidin绑定技术能比Biotin-Avidin绑定技术更显著的提高软骨细胞与支架的黏附能力，并更有助于促进TEC种子细胞的增殖和软骨细胞表型的表达。
　　 第三部分
　　 单抗CD44-生物素-亲和素绑定技术
　　 构建组织工程软骨修复猪膝关节负重区软骨缺损的效果研究
　　 目的：观察单抗CD44-生物素(Biotin)-亲和素(Avidin)绑定技术，在体外构建的组织工程软骨移植修复猪膝关节负重区软骨缺损的效果。
　　 方法：如第二部分所述分3组构建组织工程软骨。软骨细胞接种后测定接种细胞脱落率；Real-time PCR法检测组织工程软骨Ⅱ型胶原(ColⅡ)、aggrecan及sox9的mRNA表达。分4组修复猪膝关节负重区软骨全层缺损：A组植入壳聚糖支架+软骨细胞(常规组)；B组植入BA技术构建的组织工程软骨(BA技术组)；C组植入CBA技术构建的组织工程软骨(CBA技术组)；D组植入自体软骨(自体组)。12、24周后取出标本行大体观察并行Moran评分；生物力学方法评估标本弹性模量和刚度；免疫印迹(Western blot)检测新生软骨组织内的colⅡ、aggrecan目的蛋白含量；对标本行组织学HE染色、甲苯胺蓝染色和免疫组织化学染色并行Wakitani组织学评分。
　　 结果：细胞接种脱落率：A组>B组>C组(P<0.05)；ColⅡ、aggrecan及sox9的mRNA表达量：C组>B组>A组(P<0.05)；12、24周时Moran大体评分，得分越高则修复效果越好：D组>C组，但无统计学差异(P>0.05)，C组>B组>A组(P<0.05)；12、24周时生物力学检测弹性模量和刚度、Western blot检测colⅡ、aggrecan目的蛋白含量结果皆为：D组>C组>B组>A组(P<0.05)；组织切片显示C、D组修复效果相似，都较好，见大量成熟软骨细胞且基质分布均匀，而A组修复效果较差，成熟软骨细胞数量少且基质分布不够均匀，B组所见则介于A、C两组间；12、24周时Wakitani组织学评分，得分越低则修复效果越好：D组0.05)，C组　　 结论：Biotin-Avidin绑定技术比常规接种方法所构建的组织工程软骨对猪膝关节负重区软骨缺损的修复效果好，但是相比而言，单抗CD44-Biotin-Avidin绑定技术所构建的组织工程软骨的修复效果更佳，虽然仍未达到自体移植修复水平，但部分指标和自体移植已无统计学差异。