SDF-1α/Rac途径在内皮祖细胞极性调控与归巢中的作用研究

摘要

近十几年来，有关干细胞治疗退行性疾病和坏死性疾病细胞替代疗法的研究是热点。在冠心病心肌梗死或心力衰竭的细胞治疗中，细胞类型的选择上，内皮干/祖细胞是一个有希望的新生血管来源。但其“归巢”和迁移机制复杂，目前归巢和细胞再生能力差，未能临床应用。本研究拟从基础研究为手段，探讨新的hEPCs归巢调控蛋白和可能的信号通路。
　　本研究拟验证Rac蛋白在EPCs归巢中的重要作用，为冠心病的细胞治疗提
　　供新的作用途径。实验共分为以下三个部分:
　　第一部分人内皮祖细胞的培养与鉴定及大鼠内皮祖细胞的培养
　　目的:建立本实验室离体人内皮祖细胞（hEPCs，以后所出现EPCs，若无特殊说明，都为本实验中分离出的hEPCs）培养的方法，探讨培养条件、细胞生长状态、形态。与大鼠EPCs培养条件和生长情况对比。方法:取人脐带血80-120ml/袋，先分离单个核细胞，后使用磁珠细胞分选法，分选出CD133+/VEGFR2+的细胞，进行流式细胞检测，发现双阳性细胞占48.79％。用差速贴壁法培养1周，做常规拍照、免疫荧光染色拍照和细胞极性研究。结果:(1)此法提取的内皮祖细胞平均产率在3％（EPCs占单个核细胞的比例）。在普通光镜下呈索条状、卵圆形。(2)细胞吞噬DII-acLDL、UEA染料后可在荧光显微镜下特异显色，证明细胞有吞噬功能，推断为EPCs。结论:(1)该方法培养hEPCs生长活性好，在普通光镜下呈索条状、卵圆形。可以用于以后的细胞实验;但较生长状态差于大鼠EPCs;(2)差速贴壁法培养的hEPCs培养1周，可以吞噬DII-acLDL、UEA染料，呈特异显色。
　　第二部分SDF-1α对人内皮祖细胞极性和迁移的影响
　　目的:通过荧光显微镜观察分离出的EPCs在SDF-1作用下极性和细胞骨架蛋白、受体分布的变化，通过细胞迁移板Zigmond chamber来观察EPCs的迁移能力。方法:采用不同浓度的SDF-1α不同时间点与EPCs作用，观察细胞形态，进行细胞拍照。使用Fitc和主要观察了三个指标:CD133，GBP/Rac，F-actin（肌动蛋白纤维或肌动蛋白微丝）。结果:(1)光镜下观察，可见细胞形态变得细长，胞体拉伸，出现两极的“极化”现象。(2)细胞表面受体分布的变化，在SDF-1α作用组(25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml)1h、2h、6h、12h、24h时，CD133、GBP/Rac，F-actin的表达呈SDF-1剂量依赖（至少与空白对照组相比），即与SDF-1的浓度正相关;其中在SDF-1α200ng/ml的剂量组，CD133、GBP/Rac，F-actin在12小时时表达最高，而不是24小时。CD34的表达呈时间依赖，在24h时表达最高，而Rac1的表达不随时间依赖，在12h时表达最高。细胞表面受体CXCR4、CD18、Integrinα4表达的研究中，CXCR4呈时间依赖，在24小时时表达最高，而CD18和Integrinα4的表达不呈时间依赖。(3)在Zigmond chamber趋化分析皿中观察单个EPCs的迁移（24小时内）。通过建立总体EPCs的迁移的综合向量（纵向Y和横向X）分析，可以计算出EPCs迁移的角度和程度，定量证明了SDF-1作用下EPCs定向迁移能力加强。结论:EPCs在SDF-1诱导下极性发生了变化，无论在细胞形态还是细胞受体的分布均发生改变，同时EPCs的细胞群向SDF-1α方向发生了定向迁移。
　　第三部分SDF-1α对Rac蛋白调控分子机制的初步研究
　　目的:使用PCR测定SDF-1α诱导EPCs中Rac1，Rac2表达，与第二部分受体分布中SDF-1浓度和随时间变化结合，探索体外诱导最强“归巢”能力hEPCs的SDF-1剂量和时间点。观察SDF-1诱导Rac表达是否与CXCR4和p38MAPK有关。方法:分为用SDF-1在不同的干预时间点(1h，2h，6h，12h，24h)与 hEPCs共培养后，提取细胞Rac RNA测定其mRNA的表达变化，同时测定Rac蛋白及Rac-GTP蛋白的表达变化。分别使用CXCR4的抑制剂AMD3100和p38MAPK的阻断剂SB203580干预SDF-1和hEPCs的共培养，测定Rac蛋白及Rac-GTP蛋白的表达变化。结果:PCR电泳图谱观察到rac1和rac2都是在12小时表达量最高。而探究SDF-1α与EPCs中Rac蛋白及Rac-GTP蛋白表达的关系，根据western的OD值计算，在12小时Rac及其活化的Rac表达最高。加入CXCR4的抑制剂AMD3100后，rac1和rac2蛋白表达的抑制率分别为:57.1％和62.2％。加入p38MAPK的抑制剂，即为SB203580后明显抑制了SDF-1α诱导的Rac-1和Rac-2蛋白表达。结论:(1)调控Rac表达的最佳SDF-1浓度为200ng/ml，最佳时间点为12小时;(2) SDF-1α调控Rac的表达是CXCR4和p38MAPK依赖的。
　　结论
　　1.人EPCs在SDF-1α诱导下（分1h、2h、6h、12h、24h五个时间点）极性发生了变化，无论在细胞形态还是细胞受体的极化均发生改变，同时EPCs的细胞群向SDF-1α方向发生了定向迁移。
　　2.在200ng/mlSDF-1作用下，Rac蛋白在的亚型rac1和rac2其mRNA和蛋白都是在12小时表达量最高。加入CXCR4的抑制剂AMD3100，Rac1和Rac2蛋白表达明显减少;加入p38MAPK的抑制剂SB203580后Rac-1和Rac-2的表达亦明显减少，说明SDF-1α上调Rac表达，是CXCR4和p38MAPK信号通路依赖的。
　　潜在价值和创新点
　　1.建立了体外培养hEPCs的细胞培养体系;
　　2.通过Zigmond chamber的观察证明，脐血来源的hEPCs向SDF-1α方向运动;
　　3.体外调控Rac表达的最佳SDF-1浓度为200ng/ml，最佳时间点为12小时;
　　4.SDF-1α上调Rac表达，是CXCR4和p38MAPK信号通路依赖的。

目录

摘要

英文缩写(按照从正文中出现的顺序)

引言

参考文献

第一部分 人内皮祖细胞的培养与鉴定及大鼠内皮祖细胞的培养

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 SDF-1α对hEPCs极性和迁移的影响

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 SDF-1α对Rac蛋白调控分子机制的初步研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

SDF-1α／CXCR4轴在干／祖细胞“归巢”治疗缺血性心脏病中的作用机制

A novel mechanism for endothelial progenitor cells homing：The SDF-1／CXCR4-Rac pathway may regulate endothelial progenitro cells homing through cellular polarization

硕博连读期间发表的论文

硕博连读期间参加的国内学术会议及社会实践活动

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