TGF-β敏化初级感觉神经元TRPV1受体：介导骨癌痛的分子机制

摘要

根据世界卫生组织的报告，癌症是全球主要的死亡原因之一，约占所有死亡的13％。美国国立癌症研究所估计，在2010年有超过150万人被诊断出患有癌症。许多癌症，如乳腺癌，前列腺癌，甲状腺癌，肺癌以及肾癌，都很容易转移到骨组织，从而形成转移性癌症。骨组织为肿瘤细胞的侵袭和生长提供了肥沃的微环境。当癌症转移到骨组织，常常会伴随严重的疼痛和骨重塑异常发生，大大减少癌症治愈的可能性，降低患者的生活质量。
　　转化生长因子β(TGF-β)是一类骨源性生长因子。以前体的形式储存在骨组织中。破骨细胞被激活后能发生骨溶解进而释放并活化TGF-β。转移到骨的癌细胞分泌大量的促进溶骨过程的细胞因子PTHrP和IL-11激活成骨细胞和破骨细胞。成骨细胞参与新骨的生成，破骨细胞参与骨溶解过程，释放大量成熟的TGF-β。这些成熟的TGF-β为肿瘤细胞提供了很好的生长环境，使肿瘤细胞释放更多的细胞因子。这一正反馈过程导致大量的TGF-β产生和癌细胞的迁移和生长。
　　TRPV1是一类分布在外周伤害性感受器上的非选择性阳离子通道，它能被伤害热(＞43℃)、辣椒素、H+等多种物理及化学刺激所激活。TRPV1被认为是一种疼痛相关的化学或物理刺激的分子整合器。近来的研究表明，TRPV1在癌痛中起重要作用。我们知道，转移性骨癌常伴有严重的疼痛，那么肿瘤骨组织释放的大量TGF-β是否也参与骨癌痛的发生和发展呢？外周伤害性感受器上的TRPV1在其中又发挥着怎样的作用呢？
　　鉴于此，本研究在急性分离的DRG神经元上运用全细胞膜片钳记录和钙成像技术结合动物行为学测试、荧光金逆标、免疫组织化学染色和Western blot等方法，首次探讨了TGF-β在骨癌痛中的重要作用。主要结果如下:
　　1.支配大鼠胫骨癌细胞接种区的感觉神经纤维主要来自L3-L5节段DRG
　　荧光金逆向示踪的结果表明，支配大鼠胫骨癌细胞接种区的感觉神经纤维主要是来自L3、L4和L5节段的DRG。免疫组织化学染色结果显示，荧光金标记的神经元主要为CGRP阳性的肽能神经元，提示支配胫骨肿瘤区的外周感觉神经纤维主要是肽能神经纤维。
　　2.在骨癌痛发展过程中，TGF-β1、TGF-β受体和TRPV1受体的动态变化Western blot和免疫组织化学结果表明，在骨癌发展过程中，肿瘤骨组织内TGF-β1表达水平和肿瘤患侧DRG中TGF-βⅠ型受体和TRPV1受体表达上调;电生理学结果显示，骨癌14天大鼠肿瘤患侧DRG神经元TRPV1电流密度显著高于正常动物，多次重复给Capsaicin刺激引起脱敏的速率也明显低于正常DRG神经元。这些结果提示，骨癌大鼠DRG神经元TRPV1敏感性增强。
　　3.TGF-β1易化TRPV1电流并诱发热痛过敏
　　免疫组织化学结果表明，TRPV1受体与TGF-βⅠ型和TGF-βⅡ型受体在正常和骨癌动物DRG神经元均有共标;电生理和钙成像实验结果显示，TGF-β1显著易化正常和骨癌14天患侧DRG神经元TRPV1电流;动物行为学测试结果表明，鞘内给予TGF-βⅠ型受体拮抗剂SD-208剂量依赖地抑制骨癌诱发的热痛过敏;正常动物足跖皮下注射TGF-β1可直接诱发热痛过敏，预先给予TRPV1受体的拮抗剂Capsazepine可阻断之。
　　4.TAK1/p38和PKC而非ERK和JNK信号通路参与TGF-β1对TRPV1电流的调制
　　TAK1的抑制剂(5Z)-7-Oxozeaenol，p38抑制剂SB203580和PKC抑制剂BIM均可完全阻断TGF-β1对TRPV1电流的易化;而ERK激酶(MEK)抑制剂PD98059或U0126及JNK抑制剂SP600125对TGF-β1易化TRPV1效应无影响。这些结果提示TAK1/p38和PKC信号通路可能参与TGF-β1对TRPV1电流的调制。
　　5.p38和PKC信号通路参与介导TGF-β1诱发的热痛过敏
　　足跖皮下注射p38抑制剂SB203580或PKC抑制剂BIM均可剂量依赖地阻断TGF-β1诱发的热痛过敏。该结果提示TGF-β1诱发的热痛过敏可能与TAK1/p38和PKC信号通路的激活相关。
　　综上所述，本研究表明，骨转移瘤局部释放和活化的大量TGF-β1可通过TAK1/p38和PKC信号通路敏化外周感受器TRPV1受体参与骨癌痛的发生和发展。针对外周TGF-β信号通路可能对骨癌痛的治疗提供新的对策。

目录

英文缩略语表

摘要

1．前言

2．材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂和药品

2．1．3 主要实验仪器和软件

2．2 实验方法

2．2．1 大鼠骨癌痛模型的建立

2．2．2 荧光金逆标

2．2．3 足底给药和腰椎穿刺给药

2．2．4 行为学测试

2．2．5 免疫组织化学

2．2．6 Western blot免疫印迹

2．2．7 单细胞膜片钳

2．2．8 钙成像

2．2．9 统计学分析

3 实验结果

3．1 支配大鼠胫骨癌细胞接种区的感觉神经纤维主要来自L3-L5 DRG

3．2 大鼠肿瘤患侧胫骨骨组织内的TGF-β1表达上调

3．3 大鼠肿瘤患侧DRG中TGF-β受体表达的变化

3．4 大鼠肿瘤患侧DRG中TRPV1受体的变化

3．4．1 TRPV1受体蛋白表达上调

3．4．2 TRPV1受体功能性增强

3．5 TRPV1受体在大鼠DRG的分布

3．6 TGF-β对TRPV1电流的调制

3．6．1 TRPV1受体与TGF-β受体的共定位

3．6．2 TGF-β1对抗TRPV1脱敏

3．6．3 TGF-β1增大TRPV1电流

3．7 TGF-β对痛行为的作用

3．7．1 阻断TGFβRⅠ可以缓解骨癌患侧后肢的热痛过敏

3．7．2 外周给予TGF-β1可诱发TRPV1依赖的热痛过敏

3．8 TGF-β调制TRPV1电流的胞内信号通路

3．8．1 ERK／MAPK信号不参与TGF-β1对TRPV1电流的调制

3．8．2 TAK1／p38而非TAK1／JNK信号参与TGF-β1对TRPV1电流的调制

3．8．3 PKC信号通路参与TGF-β1对TRPV1电流的调制

3．9 p38／MAPK和PKC信号通路参与介导TGF-β1诱发的热痛过敏

3．9．1 阻断p38／MAPK信号通路可抑制TGF-β1诱发的热痛过敏

3．9．2 阻断PKC信号通路可抑制TGF-β1诱发的热痛过敏

4 讨论

5 总结

参考文献

综述 TGF及其受体在神经系统的研究进展

博士期间已发表文章

博士期间待发表文章

获奖情况

主要参加的学术会议

致谢

声明