锌指蛋白A20对急性肺损伤炎症反应的调控及机制研究

摘要

第一部分 A20蛋白在静脉注射LPS所致大鼠急性肺损伤中的变化及意义
　　 目的：本实验通过建立大鼠LPS所致急性肺损伤模型，旨在研究A20蛋白在LPS急性肺损伤的表达变化及意义。方法：实验选用SPF级雄性SD大鼠54只，随机分为2个实验组：正常对照组(尾静脉注射PBS，1ml/只，定义为0h)；LPS组(尾静脉注射LPS，10mg/kg，浓度为2mg/ml，根据不同时间点1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h分为8个亚组)。所有动物在注射LPS相应时间点放血处死，收集标本，观察光镜(HE染色)，检测肺湿干比(W/D)，行支气管肺泡灌洗，检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白浓度，BALF中有核细胞总数，BALF中TNF-α、IL-1β水平，肺组织NF-κB DNA结合活性及核蛋白p65水平，肺组织中A20蛋白及mRNA含量，A20定位。结果：与正常对照相比，注射LPS24小时后肺W/D、BALF中有核细胞总数(×104/ml)及BALF中蛋白浓度(ug/ml)均明显升高(p<0.05)，光镜下可见肺泡间隔增厚，有较多炎症细胞浸润，肺泡腔内可见红细胞和中性粒细胞渗出；注射LPS后，BALF液中TNF-α、IL-1β水平及肺组织中NF-κB DNA结合活性及核蛋白p65含量随时间升高，于注射后2h达高峰，之后逐渐下降，但仍高于注射前，且在24h又发生一过性升高(p<0.05)；肺组织中A20蛋白及mRNA水平也逐渐升高，于注射后2h达高峰，之后下降，但仍高于注射前(p<0.05)；免疫组化示A20在LPS注射后2小时主要表达于肺泡巨噬细胞胞浆。结论：1.健康大鼠静脉注射LPS10ml/kg24h后可出现急性肺损伤。2。急性肺损伤时，A20蛋白表达升高，且高峰期与ALI早期细胞因子及NF-κB活性一致。3.A20在急性肺损伤早期明显升高，且表达于肺泡巨噬细胞，由此推测A20可能通过调控肺泡巨噬细胞炎症活性影响肺损伤。
　　 第二部分 A20对LPS刺激后肺泡巨噬细胞炎症反应的作用及机制
　　 目的：本实验通过建立A20基因沉默及过表达肺泡巨噬细胞株研究A20对LPS刺激后肺泡巨噬细胞炎症活性影响，旨在探讨A20对LPS所致肺损伤的作用及机制。方法：实验选用大鼠肺泡巨噬细胞株(NR8383)，慢病毒法构建A20基因沉默及过表达细胞株，Western Bblot及RT-PCR鉴定A20表达，并行体外培养慢病毒包装后的A20干扰(A20-SH)、干扰空载(SCR)、过表达(A20)及过表达空载(VEC)细胞株。向培养基中加入LPS进行干预(1ug LPS/ml培养基)，于刺激后0.5、1、2、4小时收集细胞培养上清液及细胞，ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-1β水平及细胞中NF-κB DNA结合活性；Western Blot法检测A20蛋白及核内p65含量；RT-PCR检测A20、TNF-α、IL-1βmRNA含量。结果：构建的A20-SH肺泡巨噬细胞株中，A20蛋白及mRNA含量较SCR明显降低(p<0.05)，干扰效率达80％；过表达肺泡巨噬细胞中A20蛋白及mRNA含量较VEC明显升高(p<0.05)，表达增加10倍以上。LPS刺激后，SCR组及VEC组A20蛋白及mRNA含量升高，且于1h达高峰，之后逐渐下降，而A20-SH组较SCR组明显降低(p<0.05)，且始终维持在较低水平，A20组较VEC明显升高(p<0.05)。LPS刺激后各组肺泡巨噬细胞中细胞因子(TNF-α、IL-1β)mRNA及培养上清液中含量、肺组织中NF-κB DNA结合活性及核内p65含量都随时间升高，于1h达高峰，之后逐渐下降；但与SCR相比，A20-SH组明显升高(p<0.05)；与VEC组相比，A20组水平明显降低(p<0.05)。结论：1.慢病毒RNAi表达载体及A20过表达载体可分别有效地抑制大鼠肺泡巨噬细胞株中的A20基因表达或增加该基因表达。2.A20基因沉默导致肺泡巨噬细胞NF-κB活性升高，促进TNF-α、IL-1β表达及分泌；反之A20基因过表达能够抑制肺泡巨噬细胞NF-κB活性及TNF-α、IL-1β表达和分泌。3.A20蛋白能够抑制肺泡巨噬细胞炎症反应活性，进而减轻肺损伤。