侵袭性真菌感染的快速分子诊断

摘要

近三十年来，随着器官移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂使用、创伤性医疗操作等的不断增多，侵袭性真菌感染(invasive furigal infection，IFI)的发病率和病死率显著上升，尤其对免疫功能低下患者的健康构成了重大威胁。早期明确诊断是指导抗真菌治疗，降低病死率的关键，但IFI诊断非常困难，临床常用的影像学检查缺乏特异性变化，组织病理活检和培养受诸多限制，血清抗原/抗体检测则受到多种因素影响，假阳性、假阴性率较高。临床上确诊IFI主要通过无菌体液或活检组织的病原体培养，进而通过表型鉴定获取病原学依据，但这种方法耗时长，对专业技术要求高，结果的判断带有一定的主观性，已逐渐不能满足临床诊断的需要。分子生物学技术的进步为IFI的诊断提供了新的思路，与传统的培养及表型鉴定相比，分子诊断技术大大缩短了诊断所需时间，同时提高了敏感性和特异性，且操作简便、易于重复。分子诊断方法大多在培养的基础上进行病原真菌分子鉴定，也有报道某些分子生物学技术可直接从液体培养瓶，甚至临床样本中进行病原检测。
　　 第一部分临床常见致病性真菌的表型鉴定及分子鉴定
　　 目的:评价表型鉴定和分子鉴定一主要是核糖体RNA基因(rDNA)测序，在临床常见致病性真菌的鉴定方面各自的特点。
　　 方法:对55株临床常见致病性酵母类真菌、丝状真菌和无绿藻，包括8株标准菌株和47株临床/环境分离株进行表型鉴定和rDNA内转录间隔区1、2(interrlal transcribed spacer1 and2，ITS1 and ITS2)以及28s5’端D1/D2区序列测定。以表型鉴定联合rDNA测序结果作为标准，计算单个片段、多个片段：rDNA测序及表型鉴定各自的准确率。
　　 结果:表型鉴定将67.7％(21/31)的酵母类真菌和45.5％(10/22)的丝状真菌正确鉴定至种；rDNA测序的鉴定准确性高于表型鉴定，对酵母类真菌，D1/D2片段测序鉴定的准确率高于ITS1片段(83.9％VS.61.3％)和ITS2片段(83.9％VS.77.4％)；对丝状真菌，ITS1片段(68.2％VS.59.1％)和ITS2片段(63.6％VS.59.1％)测序的鉴定准确率均高于D1/D2片段测序；多个片段联合测序鉴定效果优于单个片段测序；rDNA测序法对某些进化关系非常相近的同一菌属中的菌株无法鉴定至种；联合表型鉴定和rDNA测序，本研究中所有待测菌株90.9％(50/55)鉴定至种，100％鉴定至属。
　　 结论:表型鉴定目前在临床IFI病原诊断上仍不可取代，尤其对于基因型非常相似的菌株鉴定；rDNA测序鉴定准确性高于表型鉴定，且不同的靶序列对于不同菌种鉴定价值不同，联合多个位点测序鉴定准确性高于单个位点测序；rDNA测序目前仍依赖于菌株培养，不能鉴定同时存在的病原体，对于直接从临床样本中检测病原体受到很多限制；表型鉴定联合rDNA测序可将绝大多数临床常见致病性真菌准确鉴定至种，可作为评价其他鉴定/诊断方法的标准。
　　 第二部分微流芯片一分子指纹法鉴定临床常见致病性真菌
　　 目的:构建致病性真菌微流芯片一分子指纹鉴定法，并评估其对临床常见致病性真菌的鉴定作用。
　　 方法:以临床常见的归属于10个菌属的22个菌种(包括10种酵母菌菌种和11种丝状真菌菌种)的真菌菌株为研究对象，对表型鉴定联合rDNA测序确定至种的菌株进行分子指纹PCR扩增，并以微流芯片技术检测扩增产物，建立常见致病性真菌不同菌种的M13和(GACA)4单引物微流芯片-分子指纹库。计算相似性系数以分析两种微流芯片-分子指纹的种间相似性和种内相似性，并抽取不同的菌株为研究对象来验证上述致病性真菌微流芯片-分子指纹鉴定系统的准确性。
　　 结果:成功构建了M13和(GACA)4致病性真菌微流芯片-分子指纹库用于菌株鉴定，相似性的分析结果显示，所有菌种M13和(GACA)4微流芯片-分子指纹种间相似性系数平均值分别为26.7％和26.1％，酵母类真菌和丝状真菌分别单独比对时，仅M13分子指纹中的光滑念珠菌-胶红酵母，和(GACA)4分子指纹中的马尔尼菲青霉-尖孢镰刀菌种间相似性较高(70％≤值<100％)。应用于不同真菌菌株的鉴定结果显示，当酵母类真菌和丝状真菌分别单独比对时，M13和(GACA)4致病性真菌微流芯片-分子指纹可分别将95.5％和96.4％的菌株正确鉴定至种；相似性系数(S值)≥50％的菌株之间有可能混淆；模板DNA的质量和浓度差异及不同扩增条件造成的片段大小和数量差异均有可能影响鉴定结果。
　　 结论:微流芯片技术用于分子指纹的检测大大缩短了检测时间，更加便于构建数据库及进行客观的条带比对；微流芯片-分子指纹法用于临床常见的致病性真菌菌株鉴定具有快速、准确、自动化的显著优点，尚需对操作流程进行规范化及构建更加全面的数据库；除应用于菌株鉴定外，该方法还可应用于菌种的基因分型、分子流行病学调查等领域。微流芯片-分子指纹法目前尚不具备直接从临床样本中检测真菌病原体的条件。
　　 第三部分多位点PCR-电喷射电离质谱技术鉴定临床常见致病性真菌
　　 目的:评价PCR-电喷射电离质谱技术(PCR coupled with electrosprayionization mass spectrometry，PCR/ESI-MS)对临床常见的致病性真菌，包括酵母类真菌和丝状真菌的鉴定效果，及在临床诊断中的应用前景。
　　 方法:对55株经表型鉴定联合rDNA测序鉴定至种或属的真菌病原体，包括8株标准菌株和47株临床/环境分离株进行PCR/ESI-MS鉴定，所有待测样本分为两组：PCR/ESI-MS广谱真菌鉴定系统(PLEX-ID检测平台)可检测范围内组(共47株菌株)和PCR/ESI-MS广谱真菌鉴定系统可检测范围外组(共8株菌株)。分别评价PCR/ESI-MS对两组菌株的鉴定准确性。
　　 结果:对于广谱真菌鉴定系统可检测范围内的菌株，85.1％(40/47)准确鉴定至种或种复合体，87.2％(41/47)准确鉴定至属；而系统可检测范围外的菌株，37.5％(3/8)可鉴定至属。此外，PCR/ESI-MS可检测一份样本中同时存在的多种病原体DNA。
　　 结论;PCR/ESI-MS是一种新型的、多段基因序列的碱基组成信息为基础的病原鉴定、检测技术，具有快速、准确、灵敏、可定量、可检测混合病原体等优点，在IFI临床诊断上具有很高的应用价值，还可用于突变检测、分子流行病学示踪等领域。其在IFI分子诊断上的应用尚需进一步扩大样本量进行深入研究。