海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳促进胰岛素口服吸收的研究

摘要

胰岛素是治疗糖尿病的一线药物，然而作为水溶性大分子蛋白类药物，其口服给药一直是研究的热点与难点。w/o微乳用于多肽蛋白类药物口服给药系统己被关注，它可以在一定程度上提高多肽和蛋白类药物的口服生物利用度。但是其口服给药后易在胃内转相造成药物大量泄漏而被破坏;另一方面微乳中必须使用大量的表面活性剂和助表面活性剂，长期使用可能会对消化道产生一定的刺激性，从而引起身体的不适。本文中拟制备w/o/w型纳米乳，减少表面活性剂的用量;并采用生物粘附材料海藻酸钠与壳聚糖对纳米乳剂进行包裹，保护乳剂在胃中的稳定性，并增加其在肠道内的滞留时间，提高口服生物利用度。
　　第一部分中制备海藻酸-壳聚糖包覆的纳米乳，并对处方和制备工艺进行了优化，对其体外特征进行了表征。通过两步法制备w/o/w型复乳，油相为LabrafacCC，表面活性剂为磷脂(Lipoid S75)和司盘80，外水相中含有乳化剂CremorphorEL和海藻酸钠。复乳经过高压均质制成纳米乳，之后加入CaCl2和壳聚糖进行交联形成包覆纳米乳。包覆纳米乳的粒径在488 nm左右，包封率最高可达52.3％。Zeta电位测定显示包覆纳米乳呈现负电性。圆二色谱扫描发现α螺旋与β折叠的特征峰与含量没有发生变化，证实包覆纳米乳制备过程中不会对胰岛素的结构造成破坏。通过测定胰岛素在不同pH介质中的泄露情况考察不同酸度介质对于包覆纳米乳交联壳的破坏，在此基础上考察了不同制剂在模拟胃液中的胰岛素释放情况。结果表明，在pH不低于2.5时，包覆纳米乳可以维持自身完整性不被破坏;模拟胃液释放实验的结果显示海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳在禁食状态胃液pH条件下可以很好地保护胰岛素，减少其泄漏;普通覆纳米乳与复乳内水相中胰岛素则会迅速释放。
　　第二部分对海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳体内降糖效果进行了考察。分别给予正常大鼠(wistar)与糖尿病大鼠(GK)不同剂量的包覆纳米乳和对应制剂，测定药理相对生物利用度。包覆纳米乳呈现出较好的降糖效果，并具有呈现出一定的剂量依赖性;且在糖尿病模型大鼠体内的降糖效果更明显，具有-定的长效作用。以25 IU/kg和50 IU/kg剂量灌胃给药，在正常wistar大鼠体内相对生物利用度分别为8.42％和5.72％，在GK糖尿病模型大鼠体内相对生物利用度为8.19％和7.84％。而普通纳米乳生物利用度接近于零。
　　第三部分中，对于海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳促进胰岛素口服吸收的机制进行了初步考察。首先通过体外粘蛋白结合黏度试验对包覆纳米乳的生物粘附性进行考察。实验中发现，加入包覆纳米乳与普通纳米乳后体系黏度均有不同程度的增加，随着粘蛋白浓度的增大，黏度的增大量也随之增加，包覆纳米乳较普通纳米乳的增大幅度也有显著性差异。通过共聚焦显微镜可以看到给药后2、4、6小时，包覆纳米乳的滞留时间与滞留量明显大于普通纳米乳，更远远超过胰岛素溶液。给药6小时后包覆纳米乳在空肠段与回肠段处仍有大量滞留而普通纳米乳已经开始离开小肠段。结果表明本体系良好的生物粘附效果，对于胰岛素口服生物利用度的提高也起到极其重要的作用。Caco-2细胞转运实验结果显示，包覆纳米乳中胰岛素的转运量较胰岛素溶液并没有明显变化;在杯状细胞转运实验中胰岛素溶液的转运速率及转运量甚至远高于包覆纳米乳。因此，海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳促进胰岛素口服吸收并非依赖于打开细胞紧密连接提高制剂的细胞跨膜转运，而是更多依赖于包覆壳的保护作用及包覆材料的生物粘附作用。包覆壳保护纳米乳在消化道中不会反向、破乳，从而保护了内水相的胰岛素不被消化酶等破坏失活;海藻酸、壳聚糖的生物粘附作用增加了制剂在小肠腔中的滞留时间，胰岛素通过纳米乳在粘膜层的缓慢释放后被吸收入血，从而提高了胰岛素的口服生物利用度。

目录

摘要

前言

第一章 海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳的制备、优化与表征

1 材料与仪器

1．1 药品与试剂

1．2 仪器

2 实验方法

2．1 胰岛素含量的HPLC测定法

2．2 海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳的制备

2．3 海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳处方优化

2．4 Zeta电位

2．5 透射电镜

2．6 包覆纳米乳中胰岛素二级构象

2．7 模拟胃液中稳定性考察及体外释放

3 结果与讨论

3．1 胰岛素含量的HPLC测定法

3．2 胰岛素海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳的制备与处方优化

3．4 均质条件对包覆纳米乳的影响

3．5 Zeta电位

3．6 胰岛素海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳形态

3．7 胰岛素二级构象的稳定性

3．8 胰岛素在模拟胃液中的释放

4 小结

第二章 胰岛素海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳大鼠体内降糖作用的研究

1 材料与仪器

1．1 药品与试剂

1．2 仪器

1．3 实验动物

2 实验方法

2．1 血糖的测定

2．2 正常大鼠口服包覆纳米乳体内生物利用度研究

2．3 正常大鼠海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳胰岛素剂量考察

2．4 糖尿病大鼠口服包覆纳米乳体内生物利用度研究

2．5 统计分析

3 结果与讨论

3．1 正常大鼠口服胰岛素包覆纳米乳生物利用度

3．2 不同剂量的包覆纳米乳对正常大鼠体内生物利用度的影响

3．3 糖尿病大鼠口服胰岛素包覆纳米乳生物利用度

4 小结

第三章 胰岛素海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳吸收机制的研究

1 材料与仪器

1．1 药品与试剂

1．2 仪器

2 实验方法

2．1 FITC-胰岛素合成

2．2 海藻酸-壳聚糖包覆纳米乳生物粘附性考察

2．3 细胞转运实验

2．4 统计分析

3 实验结果

3．1 体外粘蛋白实验考察

3．2 大鼠体内小肠粘附性考察

3．3 细胞转运实验

4 小结

全文总结

参考文献

致谢

声明