人超氧化物歧化酶-胸腺素α1在毕赤酵母中的表达、纯化与活性检测

摘要

胸腺素α1(Thymosin alpha-1，Thyα1)是一种小分子活性多肽。体内外实验表明，Thyα1能够影响细胞因子的分泌和淋巴细胞的功能，具有增强抗病毒、抗分支杆菌、抗真菌的能力，诱导抑制肿瘤的免疫活性，被认为是具有良好疗效的免疫调节剂和生物反应调节物(Biological Response Modifier，BRM)。Thyα1作为免疫调节剂已广泛用于各种疾病的治疗，如肝炎、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、传染性疾病、感染、变态反应、自身免疫病、神经内分泌疾病、各类肿瘤的治疗以及化疗后的免疫功能的恢复等。目前生产Thyα1方法有组织提取、化学合成和基因工程方法合成。临床使用的Thyα1多为从动物组织提取出的天然产物，纯度和活性难以控制，且生产成本昂贵。基因工程生产重组蛋白药物具有低成本、产物高活性等优势，但是由于Thyα1只有28个氨基酸，用基因工程方法重组表达时有一定的难度。
　　超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，在体内催化超氧阴离子自由基(O2-·)转化为H2O2和O2的反应，是生物体内防御氧化损伤、抗氧化的生物酶，具有抗衰老、增加机体免疫等特点，对机体具有重要的保护作用。SOD分子量较大，且在酸碱、热条件下较为稳定不易降解。大量试验和临床应用表明，在各种给药方式下，SOD毒性和不良反应均很小，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。因此，超氧化物歧化酶被广泛应用于食品、保健品、化妆品、药品领域，成为理想的对人体有益无害的添加剂。超氧化物歧化酶的基因工程产品也相继在世界各国被成功开发生产。
　　考虑到胸腺素α1在体内半衰期较短、稳定性较差的缺点，同时胸腺素与SOD具有协同增效作用，为了增强胸腺素α1的稳定性和免疫功能，本研究采用了胸腺素α1(Thyα1)与人超氧化物歧化酶(hSOD)融合的策略，构建了6His-hSOD-(G4S)1-thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-thyα1两个融合基因，并分别实现了在毕赤酵母表达系统中的高水平表达。重组表达的融合蛋白经过Ni-NTA亲和层析纯化，获得纯度达到80％以上重组蛋白。用邻苯三酚自氧化法和E-玫瑰花法分别测定了人超氧化物歧化酶活性和胸腺素活性。活性分析结果表明，融合蛋白6His-hSOD-(G4S)1-thyα1和6His-hSO D-(G4S)2-thyα1的超氧化物歧化酶比活性分别为120998U/mg和31279U/mg;融合蛋白在1×10-7 mol/L浓度下的E玫瑰花结率分别为38.4％和36.6％。结果说明融合蛋白中由5个氨基酸(G4S)构成的连接肽能有效地保障两个蛋白各自的结构特征，使融合蛋白既有超氧化物歧化酶的活性，又具有胸腺素的活性。
　　纤维素资源是地球上分布最广、含量最丰富的可再生性碳水化合物，为发展可再生生物燃料的提供了无尽的原料。木聚糖酶作为半纤维素酶的一种，其应用涉及纸浆漂白，动物饲料，生物能源等多个方面的工业、农业生产活动，因此，对木聚糖酶的研究与工业应用开发一直广为关注。天然木聚糖酶往往在耐温性、最适pH等条件上难以满足工业化生产的需要，利用基因工程手段进行酶的改造可以改善和提高酶的应用价值。
　　11家族木聚糖酶是研究较为广泛的一类木聚糖酶，目前已有很多不同来源的木聚糖酶基因被克隆、重组表达，并被解析了三维晶体结构，针对其特点进行的蛋白结构改造也被报道。本课题组游淳曾经通过定向进化和定点突变技术，获得并鉴定了该家族来源于Neocallimastixpatriciarum的木聚糖酶C(XynC)的一株突变体。该突变体内部疏水核心含有一个点突变(G201C)，导致了突变体的热稳定性明显提高，同时酶的比活也显著提高。在该突变体中，201位和50位的半胱氨酸所形成的疏水结合是导致热稳定性提高的主要原因。在基于XynC的突变体研究中，又得到了热稳定性和酶比活均比原突变体得到提高的新突变体C60A-G201 C。
　　本论文以游淳获得的突变体C60A-G201C为基础，利用随机突变技术以及DNA Shuffling技术获得了8株突变体;构建了含有突变体蛋白基因载体的表达菌株，成功实现了高水平表达，并对突变体蛋白进行了Ni-NTA亲和层析纯化;对突变体蛋白进行了热失活常数的测定，使用圆二色谱技术对突变体蛋白Tm值进行了测定，结果发现了一株热稳定性得到提高的突变体37，其热失活常数要优于未突变蛋白，Tm值要高于未突变蛋白6.12℃。通过同源建模对突变体37进行了生物信息学分析，其序列在20位由Lys突变为Glu，而20位突变的Glu与同位于蛋白Fingers区域的29位的Tyr恰好产生了一个氢键，从而稳定了蛋白的结构，实现了突变体蛋白热稳定性的提升。

目录

第一部分 人超氧化物歧化酶-胸腺素α1在毕赤酵母中的表达、纯化与活性检测

摘要

1 前言

1．1 胸腺素α1的生物学特性与应用

1．2 超氧化物歧化酶的特性

1．3 酵母系统表达蛋白的特点

1．4 立题背景和研究内容

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 重组表达菌株的构建

3．2 重组蛋白的表达与纯化

3．3 重组蛋白的超氧化物歧化酶酶活测定

3．4 重组蛋白的胸腺素活性测定

4 讨论

4．1 融合蛋白活性分析

4．2 重组蛋白的潜在优势

4．3 毕赤酵母表达系统的优缺点

4．4 连接肽对融合蛋白活性的影响

4．5 蛋白发酵与纯化策略

5 结论

参考文献

第二部分 11家族木聚糖酶热稳定性突变体的鉴定

摘要

1 前言

1．1 纤维素酶研究的重要性

1．2 木聚糖酶的改造

1．3 立题背景和研究内容

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 11家族木聚糖酶热稳定性突变体的氨基酸序列

3．2 突变体蛋白的表达与纯化

3．3 热稳定性及热失活常数的测定

3．4 圆二色谱测定热变性曲线和Tm值

3．5 突变体的生物信息学结构分析与预测

4 讨论

4．1 获得突变体的策略分析

4．2 突变体蛋白结构分析

5 结论

参考文献

致谢

硕士期间发表论文

声明