油菜素甾醇受体弱突变体bril-301抑制子的筛选、基因克隆与功能研究

摘要

油菜素甾醇(BRs)是一类重要的植物激素调控了植物生长发育的各个过程，包括细胞的伸长、细胞的分裂、衰老、维管束的分化、雄性育性和光形态建成，以及对生物和非生物胁迫的抗性等。经过几十年的研究，BR的合成和信号转导途径的组分已经研究的比较清楚。最近几年，研究者们开始关注BR信号转导途径与其他信号途径之间的互作。本文以BR受体弱突变体bril-301为背景筛选抑制子，希望找到BR与脱落酸(ABA)信号互作的结点蛋白或者组分元件。通过对大约1万粒种子进行EMS诱变，将M1的植株分成22个组，将各小组的M2代种子种在含0.75μM的ABA培养皿上进行筛选，以ABA处理后的萌发率以及在土壤中的生长发育表型为依据，筛选了对ABA不敏感或者有生长回复表型的候选突变体，得到了4类突变体:第一类ABA超不敏感并且有生长发育表型，4株;第二类ABA超不敏感，没有明显生长发育表型，2株;第三类ABA稍不敏感，没有明显生长发育表型，6株;第四类有较明显的生长发育表型，12株。
　　得到以上的突变体后，对其中一株编号为16-19的突变体开展了进一步的研究。16-19突变体能够抑制bril-301的表型，表现为下胚轴变高，叶柄变长，植株变高，开花较早等表型。图位克隆结合二代测序发现该突变体的表型是由于红光受体PHYB功能缺失导致的，PHYB的第1995个鸟苷酸G突变为腺苷酸A，也即第599位的色氨酸突变为终止密码子，导致蛋白翻译提前终止，将这个新的等位突变个体命名为phyB-69。
　　利用生理、生化和分子生物学手段研究了phyB-69与BR信号通路的关系，并得到以下结论:PhyB缺失突变体中BR信号输出被放大;PhyB的缺失影响了BR合成基因的转录水平，使得CPD、DET2有明显上调，促进BR合成;在光形态建成过程中光信号和BR相互拮抗地调控拟南芥下胚轴和叶柄的生长。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 油菜素甾醇的合成和信号途径的研究

1．1．1 油菜素甾醇的研究简史

1．1．2 油菜素甾醇的生理功能

1．1．3 油菜素甾醇的合成途径

1．1．4 油菜素甾醇水平的调控

1．1．5 油菜素甾醇的信号通路

1．2 ABA信号转导的研究进展

1．3 BR与ABA互作的研究进展及研究意义

1．3．1 研究进展

1．3．2 研究意义

1．4 BRI1突变体抑制子的筛选介绍

1．4．1 膜受体BRI1的详述以及不同的等位基因

1．4．2 bri1突变体背景下的抑制子筛选历史

1．4．3 bri1-301的获得和生理表型

1．5 本论文进行遗传筛选的初衷

1．6 PHYB参与的光信号途径的研究进展

1．6．1 光敏色素PHYB的介绍

1．6．2 PHYB参与的光形态建成的信号通路

1．7 BR与光信号互作的研究进展

1．8 本论文利用PHYB的缺失突变体研究光信号与BR的关系

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株

2．1．3 载体

2．1．4 试剂盒

2．1．5 主要的化学品

2．1．6 酶及其它

2．1．7 抗生素

2．1．8 抗体

2．1．9 图像及数据分析软件

2．1．10 主要的仪器设备

2．2 方法

2．2．1 植物材料的种植和生长

2．2．2 EMS诱变

2．2．3 候选突变体的筛选

2．2．4 拟南芥的杂交

2．2．5 图位克隆

2．2．6 二代测序DNA样品准备

2．2．7 感受态的制备

2．2．8 载体构建

2．2．9 农杆菌介导的拟南芥的转化

2．2．10 T-DNA Line鉴定

2．2．11 植物材料的激素处理

2．2．12 Realtime PCR

2．2．13 BES1的磷酸化状态检测

2．2．14 双突变的构建

2．2．15 BR／BRZ220敏感性的实验

第三章 结果与讨论

3．1 bri1-301抑制子的筛选

3．1．1 技术路线

3．1．2 筛选浓度的选择及种子数量的计算

3．1．3 初筛结果

3．1．4 突变体显隐性的分析

3．1．5 已知ABA相关突变体的排除

3．2 bri1-301抑制子的表型分析

3．2．1 根长

3．2．2 根毛

3．2．3 候选突变体分类

3．3．5 突变体16-19的显隐性

3．3．6 突变体16-19的粗定位

3．3．7 突变体16-19的精细定位

3．3．8 突变体16-19的二代测序

3．3．9 检测At2g18540的转录水平

3．3．10 T-DNA的表型比较

3．3．7 突变体16-19的精细定位

3．3．8 突变体16-19的二代测序

3．4 功能研究

3．4．1 phyB-69的表型分析

3．4．2 phyB-69中BR信号输出放大

3．4．3 phyB-69中BR合成和代谢基因的转录水平受到影响

3．4．4 phyB-69对eBL更敏感

3．5 讨论

3．5．1 EMS筛选的思考

3．5．2 确定突变基因

3．5．3 phyB-69中BR信号输出的检测

3．5．4 phyB-69对BR合成和代谢的影响

3．5．5 phyB-69对BR合成和信号的影响

3．5．6 phyB-69对eBL的敏感性

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

3．5 讨论

3．5．1 EMS筛选的思考

3．5．2 确定突变基因

3．5．3 phyB-69中BR信号输出的检测

3．5．4 phyB-69对BR合成和代谢的影响

3．5．5 phyB-69对BR合成和信号的影响

3．5．6 phyB-69对eBL的敏感性

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

附录

后记

声明