结核分枝杆菌抗原Rv3425及融合抗原Ag85B-Rv3425在结核疫苗中的治疗和保护作用研究

摘要

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的重大传染性疾病，严重威胁人类健康，全球有1/3的人口感染了结核分枝杆菌。近些年来，耐药结核菌株的出现和HIV感染使得结核病的防治形势更加严峻。目前临床上应用于治疗结核感染的抗结核药物存在治疗周期长，副作用大等诸多问题，导致病人服药的依从性很低，在一定程度上加剧了结核病的复发以及耐药结核的产生;另一方面，人类对于结核病的预防手段目前还只有接种卡介苗BCG一种方式，BCG疫苗对于不同人群的保护效果差异较大，而且对成人几乎没有保护效果，所以其保护效果并不理想。因此，探索结核病治疗新模式，研发延长保护时间的新型结核疫苗，成为目前亟待解决的两大问题。
　　本论文着眼予以上两大问题，初步探究了新型的解决方案，主要包括以下两部分:
　　1.慢病毒载体表达结核菌融合抗原Ag85B-Rv3425可以有效治疗小鼠结核感染。
　　我们首次将慢病毒作为结核病治疗性疫苗的载体，构建相关载体并包装出可以表达融合抗原Ag85B-Rv3425(简称A3)的重组慢病毒，通过小鼠体内实验证明重组慢病毒足垫单次免疫可以有效诱导融合抗原A3在小鼠体内表达并激发相应的免疫反应。小鼠体内表达的A3融合抗原经过抗原递呈识别过程，可以刺激特异性的T淋巴细胞增殖，增加小鼠体内特异性CD4+，CD8+T淋巴细胞的比例，引发小鼠体内产生针对特异性抗原的Th1型免疫反应，增强Th1型细胞因子IFN-gamma，IL-2的分泌表达，显示出良好的抗结核潜力。
　　为了检测重组慢病毒对于结核病的免疫治疗效果，我们利用尾静脉攻毒方式对C57BL/6小鼠进行了结核菌感染，对感染后的小鼠进行免疫治疗实验，治疗策略为通过足垫免疫的方式向小鼠体内注射重组慢病毒，治疗8周后，相对于对照小鼠，经过重组慢病毒治疗的小鼠肺脏内的结核菌量下降了2/3，体重明显上升，表明重组慢病毒对于感染小鼠体内的结核菌具有清除作用，表达融合抗原A3的重组慢病毒表现出良好的结核病免疫治疗前景。
　　2.表达融合抗原Ag85B-Rv3425的重组BCG初免，Rv3425蛋白作为亚单位疫苗加强免疫可以取得显著优于BCG的保护效果。
　　为了寻找保护效果优于BCG的免疫方案，我们采用了初免-加强的免疫策略，用一株免疫保护效果优于BCG的表达融合抗原A3的重组BCG菌株进行初免，分别用重组Ag85B，Rv3425进行两次加强免疫，借此来寻找最优免疫策略。我们发现，用重组A3-BCG初免，用重组蛋白Rv3425加强的免疫策略可以刺激小鼠脾脏中CD4+T淋巴细胞增殖，提高外周血PBMC中CD19+CD27+记忆型B淋巴细胞的比例，延长免疫反应持续时间，从而在结核菌入侵时可以有效激发针对结核菌的特异性免疫反应，对机体提供保护。
　　为了验证我们的免疫策略对于小鼠有保护作用，我们将免疫后的小鼠通过尾静脉注射的方式进行攻毒，攻毒后4周和8周分别对小鼠进行肺脏和脾脏菌落计数。攻毒结果证明，相对于BCG，用重组A3-BCG初免，用重组蛋白Rv3425加强的免疫策略对于小鼠的保护效果更加显著。A3-BCG/Rv3425免疫策略可以有效降低肺脏和脾脏中的活菌个数，增加小鼠的体重，表现出比BCG更加良好的保护效果。
　　综上所述，我们对目前结核病防治的两大问题进行了初步的探索研究，发现了表达融合抗原A3的慢病毒疫苗可以用来治疗结核病，重组A3-BCG初免，Rv3425蛋白加强能够获得显著优于BCG的保护效果。

目录

缩略语表

摘要

第一章 文献综述

第一节 结核病现状以及结核病的病原菌

第二节 结核分枝杆菌与宿主相互作用机制

第三节 结核分枝杆菌的逃逸机制

第四节 结核病疫苗的研究进展

参考文献

第二章 表达融合抗原Ag85B-Rv3425的治疗性疫苗的免疫和治疗效果研究

第一节 实验材料和方法

第二节 实验结果

第三节 结果分析与讨论

参考文献

第三章 Ag85B，Rv3425抗原作为加强型亚单位疫苗的免疫和保护效果研究

第一节 实验材料和方法

第二节 实验结果

第三节 结果分析与讨论

参考文献

全文总结与展望

博士期间的科研成果

致谢

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