法医毒理学中药物代谢与中国汉族人群CYP基因多态性的关联分析

摘要

涉毒案件是法医学鉴定的重要内容之一。由于人类对毒药物的代谢存在显著的个体差异，因而中毒案件的法医毒理学分析应充分考虑个体遗传因素，结合药物基因组学进行结果解释。细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）是人体中最重要的药物代谢酶。遗传机制的研究显示，药物代谢的个体差异主要由CYP基因多态性所致，若CYP基因出现碱基缺失、插入、替换、颠换等类型的突变，就会使氨基酸序列改变，导致所表达的CYP酶降低活性或者丧失活性，最终引起药物代谢异常而中毒。
　　单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）在人类基因组中数量较多，发生频率较高，在疾病相关性研究、药物基因组学、法医学等研究中发挥了重要作用。近年来基于SNP分型的药物基因组学逐渐在毒理学研究方面崭露头角，其不仅可用于筛选异常代谢人群，也可为毒理学作用机制的研究提供新的方向和方法。基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight mass spectrum，MALDI-TOF MS)基因分型技术因其高灵敏度、高特异性、高通量等优点，更符合法医生物学检材的要求，适用于CYP基因的SNP位点分型。生物样品前处理方法一直以来是毒物分析的一个研究难点。分子印迹技术(Molecular imprinting technique，MIT)是近几年发展起来的新型分子识别分离技术，因其识别性好、专一性高，可应用于生物检材中毒药物及其代谢物的分离分析。
　　本论文在国内首次针对中国汉族人群CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4和CYP1A2基因座上的50个SNP位点进行了大规模筛查分析，并在现有研究成果以及现代毒物分析技术和SNP分型技术的研究基础和起点上，以司法鉴定实践中广泛涉及的新一代非“苯二氮卓”药物唑吡坦(Zolpidem，思诺思)和阿片类药物可待因为研究对象，创建了体内毒药物及其代谢物的筛选分析体系和确证定量方法，自主研发了唑吡坦分子印迹固相萃取小柱并申请专利，用于血液和尿液中唑吡坦的分离分析。通过志愿者实验，首次考察了中国汉族人群中CYP基因多态性的分布情况，首先报道了CYP基因多态性与唑吡坦及可待因代谢之间的关系，在国内率先进行了将药物基因组学应用于法医毒理学的探索研究。主要的研究内容分为以下七部分:
　　第一部分 CYP基因分型方法的研究及评价
　　研究显示，CYP2D6，CYP2C19，CYP2C9，CYP3A4和CYP1A2参与了大部分的药物代谢。筛选出这些基因座上的50个SNP位点，创建了基于复合PCR和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术的CYP基因分型方法，并检测了200例健康中国汉族人群的血样，得到了这50个SNP位点的基因分布频率。引物是根据MassARRAY Assay设计软件设计，由0.5mL全血抽提基因组DNA，经过复合PCR得到含SNP位点的片段。MALDI-TOF-MS检测之前再经过单碱基延伸和产物纯化，即得到检测结果。同时以已知基因型的DNA样品作为质量控制样品。结果发现，CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP3A4和CYP1A2基因座上的17个SNP位点具有多态性。首次报道8个位点(rs16947，rs28371725, rs1800754, rs4244285, rs4986893, rs12248560, rs3758580, rs2242480)的分布频率在中国汉族人群和高加索人群中存在显著性差异(p＜0.01)，2个位点的分布频率和现存中国汉族人群分布频率之间存在显著性差异(p＜0.01)。通过验证，所建立的MALDI-TOF-MS SNP分型方法的准确度是100％。因此，该方法检测结果可信且适用于高通量的基因分型研究，提高了法医毒理学中毒药物相关基因筛选的效能。
　　第二部分常见毒药物的LC-MS/MS筛选体系的建立
　　为了研究体内毒药物的代谢情况，创建了生物检材中170种常见毒药物的液相色谱串联质谱(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)筛选分析体系。采用多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）模式，以目标物的保留时间和母离子/子离子对为指标进行筛选分析。建立了LC-MS/MS库和定性认定标准，并考察了分析方法的有效性。多反应监测筛选体系兼具有选择离子扫描的灵敏度和二级质谱的特征性，血液中170种毒药物筛选分析的最低检出限为0.1～10ng/mL，其中85％的毒药物检出限≤1ng/mL，达到国际领先水平。该筛选分析体系能满足法医毒物分析和临床毒物学检测中毒或治疗浓度目标物的需要，为其他多种药物代谢与CYP基因多态性的关联分析提供了技术储备，在司法鉴定实践中有重要的应用价值。
　　第三部分唑吡坦分子印迹固相萃取柱的制备及应用
　　生物样品尤其是血液、尿液中目标物的分离分析技术是本课题研究的基础。目前，生物检材中的唑吡坦分析，主要采用液液提取或固相萃取等前处理后进行液相色谱串联质谱分析。分子印迹技术(Molecular imprinting technique，MIT)是近几年发展起来的新型分子识别分离技术，因其识别性好、专一性高，可应用于生物检材中毒药物及其代谢物的分离分析。本课题以唑吡坦为模板，自主研发了特异性强、选择性高的分子印迹聚合物提取柱，建立了相应的分子印迹固相萃取方法，并申请了一项发明专利。以血液为检材，提取物用UPLC-MS/MS方法检测分析。对该方法进行方法学验证，并与传统的固相萃取技术进行了比较，发现该分子印迹固相萃取柱选择性强、灵敏度高（最低检测限为0.2ng/mL），适用于法庭科学领域唑吡坦相关实际案例的检测分析。
　　第四部分 UPLC-MS/MS法检测血液、尿液中的唑吡坦及其代谢物
　　为研究唑吡坦的体内代谢情况，本课题首次建立了同时检测生物检材中唑吡坦及其主要代谢物6-羧酸唑吡坦(zolpidem6-carboxylic acid，ZCA)及苯基-4-羧酸唑吡坦(Zolpidem phenyl-4-carboxylic acid，ZPCA)的超高效液相色谱串联质谱(Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)分析方法，并应用于鉴定实践。取0.1mL血液或尿液，加入0.9mL的乙腈（含0.1％甲酸）进行蛋白沉淀。离心后取上清液吹干，用100μL甲醇定容后进API4000Q分析，分析柱为AcquityTM UPLC HSS T3(100 mm×2.1mm，1.8μm)柱。流动相为乙腈和水（含20 mmol/L乙酸铵和0.1％甲酸），流速为0.5mL/min。血液中唑吡坦，ZPCA及ZCA的线性范围分别为0.1-300ng/mL，0.1-500ng/mL，0.1-200ng/mL，尿液中唑吡坦，ZPCA及ZCA的线性范围分别为0.1～600 ng/mL，0.1～600 ng/mL，0.1～300 ng/mL。三种化合物的检出限和定量限分别为0.05 ng/mL和0.1 ng/mL，方法的线性相关性≥0.9995，日间和日内精密度在10％以内，回收率为70.0-98.3％，基质效应为79.5-99.0％。该方法简单、快速、灵敏，能够有效地解决唑吡坦涉药案件，提高突发案（事）件的快速鉴定能力。
　　第五部分唑吡坦代谢与CYP基因多态性的关联性分析
　　以临床广泛应用，并在药物辅助犯罪案件(Drug-facilitated sexual assault，DFSA)中经常涉及到的新一代非“苯二氮卓”药物唑吡坦为研究对象，为了考察唑吡坦代谢与CYP基因多态性的关联性，选取200名汉族健康志愿者分析其基因型，筛选出具有突变基因的人群并分为4组:CYP3A4*18(wild-type，W)，CYP2C19*2(W); CYP3A4*18(mutant,M),CYP2C19*2(W); CYP3A4*18(W),CYP2C19*2(M); CYP3A4*18(M)，CYP2C19*2(M)。志愿者口服治疗剂量的酒石酸唑吡坦后采集其血液、尿液样品进行分析。结果发现，唑吡坦的氧化代谢主要是通过细胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。首次报道，若发生CYP3A4*18的突变，则会增强CYP3A4酶的活性，从而引起该基因突变人群对唑吡坦的代谢增强;若发生CYP2C19*2的突变，则会降低CYP2C19酶的活性，从而引起中国汉族人群对唑吡坦的弱代谢。该研究成果提出，不同人群对唑吡坦的代谢存在个体差异，解释相关案件时应充分考虑个体遗传因素。
　　第六部分 UPLC-MS/MS法检测尿液中的可待因及其代谢物
　　为研究可待因的体内代谢情况，本课题创建了尿液中可待因及其代谢物的超高效液相色谱串联质谱分析方法。以吗啡-d3(MOR-d3)和吗啡-3-葡萄糖醛酸苷-d3(M3G-d3)为内标，尿样用乙腈沉淀蛋白后，过SiroccoTM蛋白沉淀板，UPLC-MS/MS法分离检测尿样的中吗啡(MOR)、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷(M3G)、吗啡-6-葡萄糖醛酸苷(M6G)和可待因(COD)。尿样中COD的检出限为0.2ng/mL，定量限为0.5 ng/mL; MOR、M3G和M6G检出限为0.5 ng/mL，定量限为1 ng/mL;线性相关系数r≥0.9997;日内精密度在5％以内，日间精密度在10％以内;日内准确度大于97％，日间准确度大于94％，回收率在90％以上，基质效应在45％-90％。所建方法简便、快速、准确，可适用于法医毒理学中可待因相关案件的分析鉴定。
　　第七部分可待因代谢与CYP基因多态性的关联性分析
　　以临床广泛应用，并易造成滥用成瘾的药物可待因为研究对象，为了考察可待因代谢与CYP基因多态性的关联性，选取20名健康志愿者口服治疗剂量的复方磷酸可待因口服溶液后分时段留尿，采用UPLC-MS/MS方法检测。本研究发现，多数志愿者在单次给药0.5h内，MOR、COD浓度即达到峰值，而M3G浓度则在1h后达到峰值，M6G浓度在6h时达到峰值。另有2名志愿者因rs2242480基因突变(CYP3A4)，其吗啡峰值出现在72h，M3G和M6G峰值也出现在72h，可待因的峰值出现在80h。结果表明，该2名志愿者可能为可待因慢代谢者(PM)，摄入的可待因在人体内代谢缓慢，易造成药物蓄积。同时指出，CYP2D6基因突变易造成超强代谢者(UM)，导致吗啡过量而引起中毒，但本项研究尚未发现有超强代谢者。
　　小结
　　本课题创建了基于复合PCR和MALDI-TOF MS的中国汉族人群CYP基因座上50个SNP位点的基因分型方法，首次报道8个位点的分布频率在中国汉族人群和高加索人群中存在显著性差异(p＜0.01)，2个位点的分布频率和现存中国汉族人群分布频率之间存在显著性差异(p＜0.01)。该方法检测结果可信且适用于高通量的基因分型研究，提高了法医毒理学中毒药物相关基因筛选的效能。同时本研究首次建立了唑吡坦及其代谢物、可待因及其代谢物的UPLC-MS/MS确证定量分析方法，并自主研发了唑吡坦分子印迹固相萃取柱用于唑吡坦的分离分析，申请发明专利一项。本论文还建立了170种毒药物的LC-MS/MS分析筛选体系，为其他多种药物代谢与CYP基因多态性的关联分析提供了技术储备。所建方法简便、快速、准确，能够有效地解决摄毒、涉药案件，提高突发案（事）件的快速反应能力和鉴定效能。
　　在国内率先通过志愿者实验，考察了唑吡坦、可待因代谢与CYP基因多态性的关联性。结果发现:唑吡坦的氧化代谢主要是通过细胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。若发生CYP3A4*18的突变，则会增强CYP3A4酶的活性，从而引起该基因突变人群对唑吡坦的代谢增强。若发生CYP2C19*2的突变，则会降低CYP2C19酶的活性，从而引起中国汉族人群对唑吡坦的弱代谢。可待因的代谢主要是通过CYP2D6和CYP3A4，若发生CYP2D6基因突变则易引起超强代谢类型，若发生CYP3A4突变则易会引起可待因弱代谢型。
　　本研究首次报道了CYP基因多态性与唑吡坦及可待因代谢之间的关系，在国内率先进行了将药物基因组学应用于法医毒理学的探索研究，该研究结果可用于解释不同人群对唑吡坦及可待因代谢的差异。本研究指出，个体基因差异对药物代谢的影响在临床医学和法庭科学领域均具有重要的意义。

目录

英文缩略语注释

摘要

前言

第一部分 CYP基因分型方法的研究及评价

第二部分 常见毒药物的LC-MS／MS筛选体系的建立

第三部分 唑吡坦分子印迹固相萃取柱的制备及应用

第四部分 建立血液、尿液中唑吡坦及其代谢物的UPLC-MS-MS检测方法

第五部分 唑吡坦代谢与CYP基因多态性的关联性分析

第六部分 UPLC-MS／MS法检测尿液中的可待因及其代谢物

第七部分 可待因代谢与CYP基因多态性的关联性分析

结语

参考文献

综述 法医毒理学中毒药物代谢与CYP基因多态性的关联性研究

研究成果

致谢

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