溶葡萄球菌酶高效裂解细菌细胞壁的机制研究

摘要

金黄色葡萄球菌（金葡菌）是人类主要的病原菌，它能引起肺炎、骨髓炎、心内膜炎及败血症等多种感染性疾病。随着各种广谱抗菌药物在临床的大量不合理使用，导致金葡菌对抗生素高度耐药，造成临床治疗上的困难及病死率增高，严重威胁人类健康。因此，在合理使用抗生素的同时，也迫切需要开发与传统抗生素作用模式不同的新型抗菌药物。
　　溶葡萄球菌酶是一种由模仿葡萄球菌分泌的肽聚糖水解酶，能高效裂解金葡菌细胞壁。目前，它作为新型抗菌剂已进入临床研究用于治疗创面金葡菌感染。该酶由两个结构域组成:N-端催化结构域（催化区）和C-端细胞壁结合结构域（结合区）。在蛋白结构数据库(PDB)中，目前只有上述两个结构域同源类似物的晶体结构，即LytM（金葡菌分泌的一种自溶酶）的催化区(PDB:2B13)和ALE-1（头状葡萄球菌分泌的一种肽聚糖水解酶）的结合区(PDB:1R77)，它们与溶葡萄球菌酶的催化区和结合区分别具有63％和89％的相似性。然而，至今还未见溶葡萄球菌酶晶体结构的报道。
　　为了研究溶葡萄球菌酶如何高效裂解细菌细胞壁肽聚糖，我们展开了系列研究。首先，分别表达和纯化溶葡萄球菌酶及其两个结构域，并且检测了它们的生物活性，发现单独催化区在低盐浓度下具有很强的溶菌活性，但其活性随离子强度的上升而显著下降，当环境中NaCI浓度提高至50 mM时，它的溶菌活性只有原来的1％;然而全长溶葡萄球菌酶的溶菌活性受离子强度的干扰非常小;单独结合区具有与金葡菌非常强的亲和力，与催化区不同的是，即使在生理盐浓度(150 mM NaCI)下，结合区还保持很强的亲和力，说明结合区和催化区的组合可以显著提高溶葡萄球菌酶的溶菌活性，并耐受环境（比如盐离子）的影响。
　　为进一步了解两个结构域是如何组合在一起发挥高效溶菌活性，我们用同源模建的方法，构建了溶葡萄球菌酶催化区和结合区的三维结构模型，并通过蛋白，蛋白分子对接方法，计算预测溶葡萄球菌酶两个结构域之间的对接方式，发现在自由能最低的前20个结构中，溶葡萄球菌酶两个结构域之间没有特定的相互作用界面，催化区随机分布在结合区的各个方位，说明计算方法并不适合预测溶葡萄球菌酶两个结构域之间对接模型。
　　随后，我们用实验的方法鉴定溶葡萄球菌酶两个结构域之间的相互作用界面，应用氢氘交换质谱法比较全长溶葡萄球菌酶和它两个结构域之间氢氘交换率的变化，发现了4个肽段(aa.331-339、248-260、454-473和474-488)的氢氘交换率在全长溶葡萄球菌酶中变慢，表明这些肽段可能参与溶葡萄球菌酶两个结构域之间相互作用界面的形成。为了验证哪些肽段确实参与界面的形成，我们通过位点特异二硫键交联方法分析肽段之间的交联反应，发现有两个双半胱氨酸突变体（K332C/T464C和K336C/T464C)能够很好的形成二硫键，它们的突变位点分别位于肽段331-339（催化区）和肽段454-473（结合区）上，证明这两个肽段在全长溶葡萄球菌酶分子中紧靠在一起，说明溶葡萄球菌酶的两个结构域在溶液中通过这两个肽段相互作用形成了结构域之间的界面，此时催化区和结合区的活性中心处于同一个平面，有利于它们同时与底物结合。
　　为了研究二硫键的形成对突变体（结构域之间受到限制）生物活性产生的影响，我们比较了突变体(K332C/T464C)和野生型溶葡萄球菌酶与金葡菌细胞壁的亲和力以及它们的溶菌活性。发现结构受限的突变体与金葡菌细胞壁的亲和力没有改变，然而溶菌活性显著下降，尤其是在高盐环境下。为了确认是二硫键产生的影响，我们用DTT打开突变体分子中的二硫键，消除两个结构域之间的限制，发现它的溶菌活性又完全恢复，提示溶葡萄球菌酶两个结构域之间在一定范围内可以相对运动是该酶高效裂解细菌细胞壁的一个重要因素。
　　之前研究人员已经证明肽聚糖是一个具有弹性的网状结构，在不同离子强度条件下可以收缩或者伸展。当环境盐浓度升高，细菌细胞壁收缩，肽聚糖变得松散和无规则，溶葡萄球菌酶两个结构域之间的动力学特点可以帮助催化区迅速调整位置，结合并水解细胞壁上的底物，从而实现高效裂解细菌细胞壁。
　　本研究有助于我们更好地理解溶葡萄球菌酶高效裂解细菌细胞壁的作用机制。根据获得的结构信息，进一步可以选择合适的位点进行聚乙二醇修饰，获得具有良好体内药效学和药代动力学性质的聚乙二醇化溶葡萄球菌酶，从而扩大临床应用范围和提高疗效。

目录

摘要

一、前言

1．1 金黄色葡萄球菌的耐药性问题

1．2 新型抗菌剂——溶葡萄球菌酶

1．2．1 溶葡萄球菌酶的发现

1．2．2 溶葡萄球菌酶的理化性质

1．2．3 溶葡萄球菌酶的溶菌机制

1．2．4 溶葡萄球菌酶的克隆与表达

1．2．5 溶葡萄球菌酶的体外抗菌活性研究

1．2．6 溶葡萄球菌酶的实验动物体内药效学研究

1．2．7 溶葡萄球菌酶的临床应用研究

1．2．8 金葡菌对溶葡萄球菌酶的耐药性研究

1．2．9 溶葡萄球菌酶的药代动力学研究

1．2．10 溶葡萄球菌酶的安全性研究

1．2．11 溶葡萄球菌酶的结构研究

1．3 论文的立题依据

二、材料和方法

2．1 材料和方法

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 引物和DNA序列测定

2．1．4 培养基和抗生素

2．2 方法

2．2．1 生物信息学分析软件

2．2．2 工程菌的构建与表达

2．2．3 重组蛋白的纯化

2．2．4 重组蛋白的鉴定

2．2．5 圆二色性分析

2．2．6 比浊法测定溶菌活性

2．2．7 与金葡菌亲和力检测

2．2．8 同源模建

2．2．9 分子对接

2．2．10 蛋白氢氘交换反应

2．2．11 胃蛋白酶酶解方法

2．2．12 质谱检测酶解肽段

2．2．13 酶解肽段鉴定

2．2．14 肽段氢氘交换率分析

2．2．15 突变体的构建、表达和纯化

2．2．16 双半胱氨酸突变体的交联分析

三、结果

3．1 溶葡萄球菌酶的生物信息学分析

3．1．1 溶葡萄球菌酶的一级序列分析

3．1．2 溶葡萄球菌酶的二级结构分析

3．1．3 溶葡萄球菌酶的高级结构检索

3．2 溶葡萄球菌酶及其两个结构域的克隆、表达、纯化与活性研究

3．2．1 重组蛋白的工程菌构建和表达

3．2．2 重组蛋白的纯化和鉴定

3．2．3 圆二色性分析

3．2．4 重组溶葡萄球菌酶及其催化区对金葡菌的溶菌活性

3．2．5 重组溶葡萄球菌酶及其结合区与金葡菌的亲和力分析

3．3 溶葡萄球菌酶催化区和结合区的结构模建以及结构域之间的分子对接

3．3．3 溶葡萄球菌酶催化区和结合区的结构模建

3．3．4 分子对接预测溶葡萄球菌酶的高级结构

3．4 氢氘交换质谱法鉴定溶葡萄球菌酶结构域之间相互作用界面上的肽段

3．4．1 溶葡萄球菌酶经胃蛋白酶酶解后的肽段鉴定

3．4．2 MALDI-TOF MS检测酶解肽段的覆盖率

3．4．3 建立MALDI-TOF MS检测氘代肽段的方法

3．4．4 溶葡萄球菌酶和它的两个结构域之间的氢氘交换率比较

3．5 位点特异二硫键交联验证结构域之间的相互作用界面

3．5．4 溶葡萄球菌酶的单半胱氨酸突变体的构建及其溶菌活性研究

3．5．5 溶葡萄球菌酶的双半胱氨酸突变体的构建和交联分析

3．5．6 二硫键交联突变体(K332C／T464C)的生物活性分析

四、讨论

参考文献

总结与展望

博士期间发表的论文

致谢

声明