互花米草MTs基因的克隆及其对重金属的应答分析

摘要

金属硫蛋白（metallothionein，MT）是一类广泛存在的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。有研究报道，植物MTs在解除重金属毒害、维持金属离子稳态和清除活性氧（ROS）等方面起重要作用。
　　本实验以互花米草（Spartina alterniflora Loisel.）为材料，研究了互花米草幼苗在不同浓度CdSO4（0,0.1,0.5,0.8,1.0,3.0,5.0,10.0 mmol/L）处理下SaMT1、SaMT2、SaMT3基因的表达变化及互花米草幼苗根和叶中抗氧化酶活性的变化；克隆了互花米草3个MT基因，分别命名为SaMT1、SaMT2和SaMT3；构建过量表达载体转化拟南芥，对获得的纯合转基因拟南芥进行分子鉴定及重金属耐受性分析；构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21，对重组菌进行重金属耐性和结合特性分析。其主要结果如下：
　　1.SaMTs的表达参与了互花米草幼苗对CdSO4胁迫的应答
　　用不同浓度CdSO4处理互花米草幼苗2天，实时定量PCR分析显示SaMT1、SaMT2和SaMT3的转录明显受到CdSO4的诱导。在低浓度CdSO4处理下，SaMT1、SaMT2和SaMT3基因的表达水平随着CdSO4浓度的增加而逐渐升高；高浓度CdSO4胁迫时，表达量又有所下降。
　　2.在一定浓度范围内，互花米草幼苗可以通过提高抗氧化酶的活性来抵御重金属胁迫
　　用不同浓度CdSO4处理互花米草幼苗14天后测定各项生理指标。实验结果显示根和叶中MDA含量和相对电导率都持续升高。随着CdSO4浓度的增加，抗氧化酶类（SOD、APX、CAT、POD）的活性出现先升高又下降的趋势。
　　3.运用RACE方法克隆得到了互花米草SaMT1、SaMT2和SaMT3基因
　　SaMT1、SaMT2、SaMT3序列的ORF区长度分别为222 bp、246 bp和195 bp，分别编码73、81和64个氨基酸；Blast X分析和系统进化树分析发现SaMT1、SaMT2和SaMT3与其他植物MTs同源性很高，尤其是水稻MTs。
　　4.SaMTs的表达能够提高转基因拟南芥的抗氧化酶活性，增强重金属抗性
　　构建植物过量表达载体，渗透法转化拟南芥，分别筛选得到了6个过量表达SaMT1、9个过量表达SaMT2和11个过量表达SaMT3的纯合转基因拟南芥株系。实时定量PCR技术检测转录水平差异，分别选取2个表达量相对较高的株系进行生理指标测定。转基因拟南芥的抗氧化酶活性都比野生型拟南芥高，而MDA含量和相对电导率比野生型低。
　　5.SaMTs的表达能够增强重组菌的重金属抗性和结合重金属的能力
　　构建原核表达载体，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，对重组菌进行重金属耐性和结合特性分析，结果显示在CdSO4胁迫下表达SaMT1、SaMT2和SaMT3的重组菌比对照菌能更好的生长，并且结合Cd的含量分别是对照菌的1.95、2.7和2.17倍。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

文献综述

1 重金属污染及植物对重金属的抗性机制

1.1 重金属污染对植物的毒害

1.2 植物对重金属的抗性机制

1.3 重金属污染土壤的植物修复

2 植物金属硫蛋白的研究进展

2.1 植物金属硫蛋白的发现

2.2 植物金属硫蛋白的特性及构象

2.3植物金属硫蛋白的分类及表达特性

2.4 植物金属硫蛋白的功能

3 植物的抗氧化酶系统

3.1 ROS的产生

3.2 ROS的清除机制

4 研究背景及意义

实验部分

第一部分：互花米草幼苗对CdSO4胁迫的响应及SaMT1、SaMT2、SaMT3基因的表达谱分析

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

第二部分 互花米草SaMT1、SaMT2、SaMT3基因的克隆

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三部分 互花米草SaMT1、SaMT2和SaMT3基因的异源表达分析及功能鉴定

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

参考文献

致谢

附录一 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录