PPAR-γ配体匹格列酮对大鼠视网膜缺血再灌注损伤保护作用及机制研究

摘要

第一章大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型研究
　　目的:建立大鼠急性高眼压视网膜缺血再灌注（I/R）损伤模型，对该模型中急性眼压升高、缺血及再灌注等因素对视网膜组织形态学改变、视网膜神经元细胞凋亡以及视网膜功能学的影响进行研究，对该模型造成视网膜损伤过程中的特点进行探讨，进一步对其作为视网膜神经保护研究动物模型进行评价。
　　方法:8周龄SD大鼠，42只，建立急性高眼压视网膜缺血再灌注模型，21只双眼造模，12只单眼造模，9只正常对照。双眼模型术后1、3、7天检测大鼠视网膜电图(ERG)及视觉诱发电位(VEP)改变，视网膜铺片Niss(l)染色及DiI荧光染料上丘逆行标记观察RGC数目，视网膜切片行HE染色观察大鼠视网膜形态学变化，TUNEL染色检测视网膜组织细胞凋亡情况。单眼模型组术后7天检测VEP、ERG、RGC数目及视网膜组织形态学改变。
　　结果:正常大鼠视网膜厚度为180.8±3.33um，内丛状层(IPL)厚度为48.71±1.05um。I/R损伤后1天网膜全层厚度无明显改变(172.9±4.71um)，IPL厚度变薄（43.58±1.88um，p＜0.05 vs.对照组），损伤3天后视网膜厚度为142.3±3.55um(p＜0.01 vs.对照组)，IPL厚度为28.23±0.64um(p＜0.01 vs.对照组)，损伤7天后视网膜厚度为124.8±2.13um(p＜0.01 vs.对照组)，IPL厚度为13.56±0.52um(p＜0.01 vs.对照组)。I/R损伤3天后RGC数目明显减少，Nissl染色RGC数目约为对照组88.86％(p＜0.05)，损伤7天后进一步减少至57.18％(p＜0.01)。上丘逆行标记法损伤7天后标记RGC数目约为对照组46％(p＜0.01vs.对照)。损伤1天后大鼠ERG各成分振幅均显著下降（a、b p＜0.01 vs.对照），损伤7天后a波振幅降低约53％，b波振幅下降达到71％(p＜0.01vs.对照);VEP各成分波损伤后1天振幅均显著下降（N1P1、P1N2、N2P2与对照组之间p＜0.01），随时间推移损伤持续加重。损伤1天后，视网膜组织可见大量TUNEL标记细胞，包括RGC、INL、ONL层，损伤3天后仅见少量TUNEL阳性细胞，7天后网膜中几乎无TUNEL标记细胞。单眼模型在视网膜组织形态学及功能学损伤与双眼模型无统计学差异，损伤对侧眼与正常对照无统计学差异。
　　结论:急性高眼压引起的视网膜缺血再灌注损伤模型，可造成大鼠视网膜组织形态学及视功能损伤。该模型早期可诱导视网膜神经元凋亡，是研究视网膜神经元损伤的理想模型。损伤后进行RGC上丘逆行标记可间接反应RGC存活及功能状况。单眼造模损伤后，对侧眼形态学及功能学无损伤性改变，可作独立作为药物干预的对照。
　　第二章 PPAR-γ配体匹格列酮对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用
　　目的:本研究采用PPAR-γ化学合成配体匹格列酮经不同给药途径对大鼠急性高眼压视网膜缺血再灌注损伤模型进行预处理，探索PPAR-γ配体对视网膜损伤过程中可能存在的保护作用。
　　方法:8周龄SD大鼠，80只，随机分为I/R组、匹格列酮1.0mg/kg腹腔注射、匹格列酮0.125mg球旁注射及正常对照组，每组20只，取右眼为实验眼。I/R损伤前3小时匹格列酮给药组进行预处理。术后24小时视网膜组织切片行TUNEL染色检测视网膜组织细胞凋亡情况，损伤后7天进行RGC计数、视网膜切片行HE染色观察大鼠视网膜形态学变化、检测大鼠视网膜电图(ERG)及视觉诱发电位(VEP)评估视功能。
　　结果:大鼠视网膜I/R损伤后7天，视网膜组织各层厚度显著下降，(I/R组视网膜厚度119.3±3.593um，p＜0.05 vs.Control;内丛状层(IPL)厚度:13.45±0.476um，p＜0.01 vs.Control）。匹格列酮给药组均显著减轻视网膜萎缩变薄，腹腔注射组视网膜厚度为143.7±7.967um(p＜0.01vs.I/R)，IPL厚度:25.54±2.018um(p＜0.01vs.I/R);球旁给药组视网膜厚度为158.2±5.848 um(p＜0.01vs.I/R)，IPL厚度:34.84±1.429 um(p＜0.01 vs.I/R)。球旁给药组较腹腔给药组IPL厚度增加(p＜0.05)。I/R损伤7天后，存活RGC约为1141.14±82.89/mm2(p＜0.01 vs.Control)。匹格列酮腹腔给药组RGC存活数目为1890.53±68.96/mm2(p＜0.01 vs.I/R);球旁给药组为1954.43±38.16/mm2(p＜0.01 vs.I/R)。匹格列酮给药组损伤后ERG a、b波振幅、VEPN1-P1、P1-N2、N2-P2均较I/R损伤组均显著增加(p＜0.01 vs.I/R)且球旁给药组N1-P1及N2-P2振幅高于腹腔给药组(p＜0.01 in N1-P1;p＜0.05 in N2P2)。I/R损伤后24小时视网膜组织中TUNEL标记细胞数目为13.85±1.67 cells/field(p＜0.01vs.Control)，匹格列酮腹腔给药组为6.2±0.51 cell/field(p＜0.01vs.I/R)，球旁给药组为8±0.58cell/field(p＜0.01 vs.I/R)。两种不同方式给药组之间TUNEL标记细胞数目无显著统计学差异。
　　结论:匹格列酮预处理后能够有效地保护I/R所造成的视网膜组织形态学损害，改善功能学损伤并且增加有功能的RGC存活率，抑制视网膜组织神经元的凋亡，且眼球旁局部给药效果优于全身给药。
　　第三章匹格列酮对大鼠视网膜缺血再灌注损伤保护机制研究
　　目的:基于匹格列酮对大鼠视网膜I/R损伤后视网膜形态学及功能学的保护作用，对其保护机制做进一步探索。
　　方法:8周龄SD大鼠，96只，随机分为I/R组、匹格列酮1.0mg/kg腹腔注射、匹格列酮0.125mg球旁注射及正常对照组，每组24只，取右眼为实验眼，I/R损伤前3小时匹格列酮给药组进行预处理。损伤后24小时Western Blot检测视网膜组织凋亡Bax、Bcl-2、Phospho-ERK(1/2)、ERK(1/2)及PPAR-γ表达，损伤后24小时及7天Western Blot、Realtime PCR、免疫组织化学法检测视网膜组织中活性GFAP表达、TNF-a表达及NF-kB P65激活。
　　结果:大鼠I/损伤后24小时视网膜组织中Bax/Bcl-2水平显著增高，ERK(1/2)磷酸化水平上调，PPAR-γ表达水平较正常大鼠下调(p＜0.01)，匹格列酮给药组Bax/Bcl-2比值较I/R损伤组显著降低(p＜0.01)，球旁给药组Bax/Bcl-2低于腹腔给药组(p＜0.01)。p-ERK/ERK水平显著低于I/R损伤组(p＜0.01);PPAR-γ表达水平显著上调(p＜0.01 vs.I/R; p＜0.01 vs.Control)。I/R损伤后24小时，视网膜组织表层部分区域Müller细胞终足GFAP染色阳性。损伤7天后，GFAP活性区域贯穿整个网膜且网膜组织中GFAP蛋白表达显著上调。匹格列酮给药组大鼠视网膜组织活性GFAP免疫染色区域显著减少且GFAP蛋白表达较损伤组下调(p＜0.01vs.I/R)，GFAP mRNA水平表达趋势与蛋白水平一致。I/R损伤后24小时视网膜组织见NF-kB P65核染色阳性细胞，各实验组NF-kB P65表达无显著统计学差异。损伤7天后NF-kB P65核染色阳性细胞增加，伴TNF-a表达上调。匹格列酮预给药组NF-kB P65核染色阳性细胞较损伤组均显著减少(p＜0.01vs.I/R)，NF-kB P65蛋白表达水平较I/R损伤组显著下调(p＜0.01)，磷酸化水平明显低于I/R濒伤组(p＜0.01)，且TNF-a表达亦明显下调(p＜0.01)。不同方式给药组之间NF-kB P65、TNF-a表达无显著统计学差异。
　　结论:大鼠视网膜I/R损伤过程中匹格列酮通上调Bcl-2而发挥抗凋亡作用，可抑制I/R引起的胶质细胞激活，并通过对NF-κB信号通路的调控抑制损伤后炎症反应的激活。MAPK信号通路也涉及其中。

目录

摘要

前言

第一章 大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二章 PPAR-γ配体匹格列酮对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三章 匹格列酮对大鼠视网膜缺血再灌注损伤保护机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

小结

参考文献

致谢

附录一 中英文缩略语对照

附录二 文献综述 PPAR-γ配体神经保护研究进展

附录三 在读期间发表论文

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