人口腔扁平苔藓角质形成细胞系的建立与鉴定

摘要

目的:
　　本实验拟通过改进和完善对人口腔扁平苔藓角质形成细胞体外培养的方法，在体外建立可重复的人口腔扁平苔藓角质形成细胞系，对其生物学行为进行研究。并从基因及蛋白角度检测MMP-2、MMP-9、CK-10及CK-19在其的表达，以期证明体外所培养的是具有扁平苔藓病理特征的细胞系。
　　方法:
　　1.细胞培养:
　　选择临床及WHO标准病理确诊的白纹型口腔扁平苔藓患者颊黏膜活检标本;采用冷酶消化法分离细胞，选用无血清培养基进行原代及传代培养;在相差显微镜下观察并记录细胞形态变化;MTT法测定细胞的生长曲线，研究此细胞体外生长的增殖情况。
　　2.细胞鉴定:
　　采用免疫荧光法进行上皮细胞角蛋白检测，确定上皮性来源;采用免疫组化法对波形蛋白进行检测，排除成纤维细胞混杂;扫描电镜和透射电镜观察细胞超微结构，进一步鉴定细胞特性;基因检测Cytochrome C、Cytochrome B、18S rDNA，确定细胞种属性。
　　3.细胞表达特异性:
　　免疫荧光测定MMP-2、MMP-9、CK-10及CK-19在OLP角质形成细胞和正常角质形成细胞内的表达;RT-PCR法和Western-blot法测定MMP-2、MMP-9、CK-10及CK-19在OLP角质形成细胞同正常角质形成细胞在基因及蛋白水平的表达差异。
　　结果:
　　1.白纹型OLP角质形成细胞可在无血清培养基中进行体外培养，可连续传5～6代，整个细胞生长期间为单一的角质形成细胞，细胞为多角形，长到一定密度呈现典型的铺路石状，符合上皮细胞生长形态特征。OLP角质形成细胞的生长曲线基本呈“S”型，传代周期约6～7d，一般7d左右能达90％以上融合。
　　2.角蛋白间接免疫荧光反应阳性，即角蛋白阳性表达，定位于胞浆，能够鉴定培养细胞为角质形成细胞。免疫组化阴性，即波形蛋白阴性表达，能够说明所培养细胞为单一角质形成细胞，无成纤维细胞混杂。扫描电镜显示:细胞周边微绒毛呈辐射状，长短不一;因微绒毛是上皮细胞的特征性结构之一，可以鉴定所培养细胞为上皮来源的角质形成细胞。透射电镜显示:正常角质形成细胞内可见大量线粒体、内质网，桥粒等结构，细胞连接紧密;OLP角质形成细胞内可见大量的空泡性结构，部分空泡内有吞饮细胞器后的膜性结构，这一病理性变化与OLP组织的特征性超微结构变化相一致，能够进一步鉴定我们培养的细胞为OLP角质形成细胞。通过提取细胞的DNA，进行Cytochrome C、Cytochrome B、18S rDNA测序分析，说明培养的细胞为人源性。
　　3.免疫荧光，RT-PCR及Western-blot结果表明MMP-2、MMP-9、CK-10在OLP角质形成细胞质中较正常角质形成细胞表达高，CK-19表达低，说明所培养的细胞具有OLP的部分病理特征。
　　结论:
　　1.白纹型OLP角质形成细胞可在体外培养，连续传代5-6代，细胞呈现典型的铺路石状，符合上皮细胞形态特征。
　　2.通过角蛋白间接免疫荧光法、波形蛋白免疫组化法、超微结构、种属性等细胞定性研究，严格设立对照组，能够鉴定所培养的细胞为人OLP角质形成细胞。
　　3.通过免疫荧光、Western-blot、RT-PCR检测MMPs-2、9和CK-10、19在所培养细胞中的表达，表明体外建立的人OLP角质形成细胞系能够代表此疾病的部分特征。为体外研究OLP的发病机制、治疗奠定了基础，具广阔的社会效益和经济效益。

目录

摘要

缩略词表(Abbrebiation)

前言

第一部分 人口腔扁平苔藓角质形成细胞系的建立

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 人口腔扁平苔藓角质形成细胞系的鉴定

引言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 MMPs-2，9和CK-10，19在口腔扁平苔藓角质形成细胞与正常颊黏膜角质形成细胞中的差异表达

引言

材料与方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 口腔扁平苔藓体外细胞模型构建的相关研究进展

致谢

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