阿西替尼对胶质母细胞瘤及其肿瘤干细胞治疗作用的研究

摘要

课题取自美国国立卫生研究院基金，探索新型口服选择性泛受体(VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3)、PDGFR-α、PDGFR-β、C-KIT酪氨酸激酶抑制剂阿西替尼(AG-013736)对胶质母细胞瘤细胞及其肿瘤干细胞是否有抗肿瘤和抗血管形成作用以及作用机制。
　　本课题探索阿西替尼对U87胶质母细胞瘤细胞、胶质母细胞瘤肿瘤干细胞GBM4EF、GBM8EF、GBM18EF、BT74（GBM肿瘤干细胞取自GBM患者）和前列腺癌PC-3肿瘤细胞（阳性对照）的抗肿瘤生长及抗血管内皮细胞的血管形成作用。此外，我们开发了溶瘤细胞病毒oHSV47△-白细胞介素12（oHSV47△-IL12）。不仅oHSV47△-IL12单独具有抗胶质母细胞瘤细胞及其肿瘤干细胞的作用，而且阿西替尼与oHSV47△-IL12联合抗肿瘤生长效果明显，具有协同治疗作用。
　　在获得体外实验数据后，我们建立了一系列的肿瘤异位和原位模型。在比较了几种给药方法后，我们用PEG400代替CMC来溶解阿西替尼作为优化给药方案（腹腔注射，25毫克/公斤体重，每日一次）。其结果显示，对于阳性对照组PC-3皮下模型，阿西替尼能够使PC-3肿瘤的体积显著减小，而且在毒理作用上是初步安全的。恶性脑肿瘤皮下模型的动物实验表明，阿西替尼组的肿瘤体积远远小于对照组，溃疡发生的时间也明显推迟。在建立的恶性脑肿瘤的颅内模型的生存实验中，阿西替尼组的中位生存期为25天，最长生存时间为28天;而对照组的中位生存期为20天，最长生存时间为22天(P＜0.005)。在药物安全性实验中，两组没有显著性差异(P＞0.05)。
　　随后病理实验的HE染色显示，裸鼠的肿瘤接种成功率是100％。对照组与阿西替尼组相比，其肿瘤细胞的密度更高(P＜0.001)，细胞核较大且深染。同时，CD34免疫组化显示对照组的血管内皮细胞密度大于阿西替尼组(P＜0.001)。阿西替尼能下调血管内皮生长因子受体磷酸化从而显著降低微血管密度和抑制肿瘤血管生长。
　　以上结果表明，在体外实验中，阿西替尼对U87胶质母细胞瘤、胶质母细胞瘤肿瘤干细胞(GBM4EF、GBM8EF、 GBM18EF、BT74)和前列腺癌PC-3细胞具有抗肿瘤生长的作用。在体内实验中，阿西替尼可显著缩小恶性脑肿瘤皮下模型的肿瘤体积，延长荷瘤裸鼠生存期，并且它在毒理上是初步安全的。其机制是通过抑制肿瘤微血管形成和生长来抑制肿瘤。
　　第一部分溶瘤病毒G47△-IL12对胶质母细胞瘤细胞及其肿瘤干细胞的杀伤作用
　　目的:建立各种胶质瘤肿瘤干细胞株，并创建了新的oHSV47△-IL12，探索其对胶质母细胞瘤和神经胶质瘤肿瘤干细胞的杀伤作用。
　　方法:从胶质母细胞瘤患者中提取、验证和培养的胶质瘤肿瘤干细胞株，运用基因工程将IL12从载体导入到oHSV47△;然后，我们进行oHSV47△-IL12感染GBM干细胞实验。
　　结果:神经胶质瘤肿瘤干细胞可以自我更新、分化，且干细胞标志物CD133、Nestin阳性。IL12通过基因工程成功导入oHSV47△，创建了oHSV47△-IL12。
　　结论:从恶性胶质细胞瘤患者体内成功提取、分离胶质母细胞瘤肿瘤干细胞GBM4EF、GBM8EF、GBM18EF、BT74，其CD133、Nestin阳性;应用基因工程技术建立的oHSV47△-IL12，对胶质母细胞瘤肿瘤干细胞GBM4EF、GBM8EF、GBM18EF、BT74具有感染和杀伤的作用。
　　第二部分阿西替尼对胶质母细胞瘤细胞及其肿瘤干细胞的抗肿瘤作用
　　目的:探讨抗血管生成靶向药物阿西替尼单独或与oHSV47D IL-12联合应用是否对U87胶质母细胞瘤细胞、胶质母细胞瘤肿瘤干细胞(GBM4EF、GBM8EF、GBM18EF、BT74)和前列腺癌PC-3肿瘤细胞（阳性对照）具有抗肿瘤生长、抗血管内皮细胞形成作用及其初步机制。
　　方法:用细胞生存计数实验，MTS法检测细胞存活率;并观察细胞形态学改变;阿西替尼和oHSV47△-IL12联合杀伤GBM干细胞;同时通过血管内皮细胞形成实验来探究其机制。
　　结果:在阿西替尼或者oHSV47△-IL12干预下，脑肿瘤细胞和肿瘤干细胞的存活率明显降低。阿西替尼抑制细胞增殖具有剂量依赖性，GBM4EF的IC50为5μ m，GBM8EF的IC50为0.1μ m，GBM18EF的IC50为100μ m; oHSV47△-IL12感染GBM干细胞的比例随着MOI的增加而增加;同时阿西替尼可以有效抑制血管内皮细胞管腔形成。
　　结论:阿西替尼对U87胶质母细胞瘤细胞，胶质母细胞瘤肿瘤干细胞(GBM4EF、GBM8EF、GBM18EF、BT74)具有抗肿瘤生长、抗血管内皮细胞的管腔形成的作用。阿西替尼与oHSV47△-IL12联合抗肿瘤细胞活性效果更加明显，具有一定的协同作用。
　　第三部分阿西替尼对胶质母细胞瘤原位和异位模型的抗血管生成作用
　　目的:探索阿西替尼在恶性脑肿瘤体内实验中的抗肿瘤作用和初步机制研究，为阿西替尼临床应用提供一定的实验依据。
　　方法:对比选择给药方法。作为阳性对照，检测阿西替尼对前列腺癌PC-3异种移植模型的抗肿瘤效果。再建立恶性脑肿瘤的异种移植和原位移植模型。在异位移植模型中，通过测量阿西替尼对肿瘤体积、重量、肿瘤溃疡形成时间以及荷瘤裸鼠体重的影响来评价药物治疗的效果。在原位移植模型中，评估对荷瘤裸鼠生存时间的影响、药物毒性以及肿瘤血管的形态、微血管密度。同时探索阿西替尼的抗恶性脑肿瘤机制。
　　结果:使用优化给药程序（PFG400溶解，腹腔注射，25毫克/千克体重，每日一次，10天），阿西替尼能抑制PC-3肿瘤异位移植模型（阳性对照），明显抑制肿瘤体积的增长(P＜0.001)。此外，显示药物对恶性脑肿瘤的异位和原位移植模型均具有显著的抗肿瘤效果同时在给药范围内具有安全性。免疫组化染色显示，与对照组相比，阿西替尼可显著抑制肿瘤组织内的血管生成，降低微血管密度(P＜0.001)，抑制肿瘤的生长，延长荷瘤裸鼠生存期(P＜0.01)。
　　结论:恶性脑肿瘤的原位模型显示阿西替尼能够显著抑制肿瘤体积的增长，并在毒理上初步是安全的。在恶性脑肿瘤的原位模型中，阿西替尼较对照组显著延长荷瘤裸鼠的生存期。机制显示阿西替尼能够抑制肿瘤微血管形成和生长，可使肿瘤细胞生长速度减缓及血管化程度降低。

目录

声明

缩略词表

摘要

引言

参考文献

第一部分 溶瘤病毒G47Δ-IL12对胶质母细胞瘤细胞及其肿瘤干细胞的杀伤作用

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 阿西替尼对胶质母细胞瘤细胞及其肿瘤干细胞的抗肿瘤作用

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 阿西替尼对胶质母细胞瘤原位和异位模型的抗血管生成作用

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

全文小结

综述 恶性胶质瘤干细胞的抗血管生成治疗

后记