小鼠结肠癌脑转移实验模型的建立及结肠癌细胞脑高转移亚株的筛选鉴定

摘要

转移性结直肠癌总体生存期的延长、患者基数的增加以及影像学技术的进步使得结直肠癌脑转移逐渐从偶然的临床事件升级为不容忽视的临床问题。而与日俱增的发病率以及和未发生脑转移的结直肠癌患者相比极差的预后将使得脑转移成为日后阻碍结直肠癌患者疗效进一步提升的最大瓶颈。
　　和结直肠癌肝转移和肺转移相比，脑转移的研究可以说尚未起步。除了少量临床回顾性研究探讨结直肠癌脑转移的诊断及手术、放疗和药物治疗的疗效和预后外，基本处于空白状态。虽然结直肠癌脑转移的治疗手段较20多年前有了长足的进步，但总体预后却没有明显改善。究其原因，除了本身病期较晚外，对脑转移的发生发展机制知之甚微也是重要原因。开展结直肠癌脑转移的基础研究迫在眉睫。稳定可靠的转移动物模型必不可少。
　　目前国内外尚无成功建立稳定可靠的结直肠癌脑转移动物模型的报道。本研究即以建立稳定可靠的结肠癌脑转移动物模型并筛选对脑组织具有高度亲和力的脑高转移结肠癌细胞系为目的。第一部分，通过颈内动脉注射细胞悬液法初步建立小鼠结肠癌脑转移实验模型并采集模型基线数据。第二部分通过体内连续筛选建立小鼠结肠癌脑高转移细胞系并加以鉴定。通过本研究应能初步建立稳定的结肠癌脑转移实验模型。为探索结直肠癌脑转移机制提供研究工具。并为进一步建立结肠癌自发脑转移模型奠定坚实基础。
　　第一部分颈内动脉注射鼠源性结肠癌细胞悬液法建立小鼠结肠癌脑转移实验模型
　　目的：
　　1、采用颈内动脉注射结肠癌细胞悬液法初步建立小鼠结肠癌脑转移实验模型。
　　2、采集该模型的转移发生时间、发生形式、发生率等基线数据，探索理想的监测方法，为后续实验进一步完善该模型提供依据。
　　方法：
　　1、以绿色荧光蛋白(GFP)标记的CT-26小鼠结肠癌细胞(CT-26/GFP)悬液进行BALB/c小鼠颈内动脉注射，即刻及5分钟牺牲取脑冰冻切片荧光显微镜下检查脑毛细血管中是否有表达GFP的肿瘤细胞存在以验证颈内动脉注射法合理性。
　　2、取20只BALB/c小鼠作为第一组，为自然观察组，颈内动脉注射CT26小鼠结肠癌细胞悬液。术后仅对其体重进行监测，并观察其自然生存期。
　　3、取100只小鼠，随机分为5组，每组20鼠，标记为第二至第六组。由同一组手术人员对其实施颈内动脉注射CT26结肠癌细胞悬液手术，分别于术后第10、20、30、40、50天进行临床表现（神经症状、恶病质等）观察及头颅磁共振显像。记录并统计神经症状及磁共振阳性发现率。
　　4、观察完毕后全组小鼠即刻牺牲取脑，并进行大体及切片镜下病理学观察。记录并统计病理阳性率（包括肉眼或10×显微镜可见或MR可发现的明显转移、微转移及总转移率）
　　结果：
　　1、接受CT26-GFP注射的小鼠脑冰冻切片均可见脑实质毛细血管中有发亮的绿色荧光，证实颈内动脉注射法能可靠地将结肠癌细胞注入脑微循环。
　　2、接受CT26注射的小鼠平均自然生存期为58.72±14.42天，其中存活时间＞50天者占84.2％。
　　3、在正式实验的100只小鼠中，3只小鼠因手术或麻醉并发症死亡，手术成功率达97％。
　　4、颅外转移导致小鼠在观测时点之间死亡，无法进行观测的有4只，加上手术并发症，总并发症率在7％。
　　5、病理微转移阳性率最早术后10天开始出现阳性，随时间先逐步升高，第30天时达最高，为55.6％，此后则逐渐下降，至第50天时为0.0％6、病理明显转移阳性率最早术后20天起出现阳性，随着时间推移逐步上升，至第50天时为50％。
　　7、磁共振最早术后20天起出现阳性表现，为右侧单发转移。自第30天起出现多发转移。MR阳性率随时间推移逐渐升高，第50天阳性率达50％，且出现双侧半球转移。
　　8、最早术后第30天起出现阳性神经症状，其比例逐渐增加，至第50天比例为38.9％。
　　9、磁共振对包括微转移的总体转移诊断敏感性为45.2％，特异性为100％。而剔除微转移后，磁共振对明显转移灶（肉眼或10×显微镜可见）诊断的敏感性及特异性均为100％
　　10、神经症状对包括微转移的总体转移诊断敏感性为28.6％，特异性为100％。而剔除微转移后，神经症状对明显转移灶诊断的敏感性为63.2％，特异性为100％。
　　结论
　　1、应用正常免疫小鼠(BALB/c)及鼠源性结肠癌细胞系(CT26)，通过颈内动脉注射瘤细胞悬液的方法首次成功建立小鼠结肠癌脑转移实验模型并积累了模型相关基线数据。建模方法安全可靠。
　　2、头颅磁共振成像可作为小鼠结肠癌脑转移实验模型转移监测和评估的无创手段。
　　3、该实验模型转移潜伏期偏长，转移率偏低，需要对致瘤细胞株进行进一步筛选以缩短转移潜伏期，提高转移率，完善模型。
　　第二部分小鼠结肠癌细胞脑高转移亚株的筛选及初步鉴定
　　目的：
　　筛选并鉴定具有脑高转移能力的小鼠结肠癌细胞株。
　　方法：
　　1、初代20只小鼠颈内动脉注射CT26细胞悬液，待50天后以磁共振检查确定脑转移阳性者，牺牲取脑取出转移瘤组织，原代培养后扩增纯化，再次制成细胞悬液注射，5个循环筛选出具有脑高转移能力的亚株CT26-B。
　　2、应用流式细胞术、Transwell小室法、划痕法等细胞生物学方法检测并比较CT26-B与原代细胞CT26的体外增殖、黏附、侵袭、运动等相关转移特性。
　　3、将CT26-B与CT26分别接种20只BABL/c小鼠，术后第50天行磁共振及牺牲行病理学检查，比较两者脑转移形成率及成瘤特性。
　　4、采用CT26-B及CT26细胞所致脑转移组织切片（白片）进行免疫组化染色，比较两者VEGF及MMP-9的表达情况
　　结果：
　　1、两株细胞前期（第1至第3天）生长速度基本一致，但后期（第4天后）CT26-B的生长速度快于CT26。CT26-B与CT26细胞倍增时间(TD)分别为30.2h和32.6h，CT26-B细胞的生长速度高于原代CT26细胞(p＜0.05)
　　2、CT26细胞株细胞周期各时相的百分率分别为G0-G1期66.70±2.04％，S期22.71±2.11％，G2-M期10.60±2.14。而CT26-B细胞株细胞周期各时相的百分率分别为G0-G1期57.64±1.40％，S期17.09±8.53％，G2-M期25.28±7.96％。CT26-B细胞G2-M期和S期细胞所占比例高于原代CT26细胞，其增殖指数高于原代CT26细胞(42.36±1.40％ vs.33.30±1.94％，p＜0.05)。说明经体内筛选后CT26肿瘤细胞恶性程度增加。
　　3、CT26-B细胞株比CT26具有更强的克隆形成能力(37.25±6.72％ vs.10.45±4.35％，p＜0.05)
　　4、CT26-B在体外同基底膜蛋白组分的粘附能力明显高于原代的CT26细胞(p＜0.05)。
　　5、CT26-B体外侵袭力明显强于CT26。CT26细胞株在体外侵袭实验中穿过Matrigel和微孔滤膜到达下室面的细胞数分别为67.2±6.3个和35.2±5.3个(p＜0.05)
　　6、CT26-B的体外运动能力明显强于CT26细胞株（划痕法），CT26-B24 h后迁移距离为(428±74.8)μ m，CT26细胞迁移距离为(178.7±21.3)μm(p＜0.05)。
　　7、实验组小鼠（接种CT26-B）术后50天脑转移率为73.7‰对照组小鼠（接种CT26）为47.3％。两者有显著性差异(p＜0.05)。
　　8、CT26-B及CT26所致脑转移组织的VEGF阳性率分别为96.7％和42.8％，MMP-9阳性率分另别为97.6％、48.4％。CT26-B高表达VEGF和MMP-9，为强阳性+++，而CT26二者皆为阳性+(p＜0.05)。
　　结论：
　　1、应用CT26小鼠结肠癌细胞悬液颈内动脉注射-脑转移体内连续筛选法，筛选出具有脑高转移能力的亚株，命名为CT26-B，其体外转移相关能力（增殖、黏附、侵袭、运动）及体内脑转移形成率均显著高于原代细胞CT26，可用于更好地建立结肠癌脑转移实验模型。
　　2、VEGF及MMP-9在CT26-B所致脑转移组织中的表达明显高于CT26，提示该两者可能在结肠癌脑转移过程中起到重要作用。
　　3、尚需进一步研究验证CT26-B的其他靶器官转移潜力，进一步体内外筛选以改善其特异性并稳定其转移表型。

目录

摘要

前言

第一部分：颈内动脉注射鼠源性结肠癌细胞悬液法建立小鼠结肠癌脑转移实验模型

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分：小鼠结肠癌细胞脑高转移亚株的筛选及初步鉴定

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

综述 构建大肠癌转移动物模型的研究进展

致谢

附录一 缩略语中英文对照表

附录二 在读期间发表文章、参与课题清单

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