基因多态性对卡马西平及其衍生物奥卡西平药动学及药效学的影响

摘要

本文分析了基因多态性对卡马西平及其衍生物奥卡西平药动学及药效学的影响。本研究分为四个部分：
　　第一章：HPLC法测定抗癫痫药物浓度的方法建立。
　　目的：建立同时测定人血浆中唑尼沙胺（zonisamide，ZNS）、扑米酮(primidone，PRI)、拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)、苯巴比妥(phenobarbital，PB)、苯妥英(phenytoin，PHT)、奥卡西平(oxcarbazepine，OXC)、卡马西平(carbamazepine，CBZ)及两种活性代谢物单羟奥卡西平（monohydroxycar-bazepine，MHD）、环氧卡马西平（carbamazepine10，11-epoxide，CBZE）浓度的HPLC方法。
　　方法：以盐酸普萘洛尔为内标，血浆样品经甲醇蛋白沉淀法处理后直接进样测定。色谱柱采用Agilent Zorbax RX-C8柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇∶乙腈∶0.1％三氟乙酸水溶液(235∶120∶645，v/v/v)，流速为1.5 mL· min-1，双波长双通道检测，在215 nm测定PRI、LTG、MHD、PB、PHT和CBZE，235 nm处测定ZNS、OXC和CBZ。
　　结果：血浆内源性杂质和常用合并用药对样品测定无干扰，色谱峰分离良好，ZNS、PRI、LTG、MHD、PB、CBZE、OXC、PHT和CBZ的最低定量下限分别为1.0，5.0，1.0，1.0，5.0，1.0，0.5，1.0，1.0μg·mL-1，线性范围分别是1～80，5～50，1～25，1～50，5～100，1～10，0.5～25，1～50，1～25μg·mL-1，相关系数(r)均大于0.996。平均方法回收率分别为101.26％，101.33％，101.31％，105.08％，100.08％，100.04％，101.64％，103.27％和102.09％。各组分的日内、日间RSD均小于11.58％。样品在25℃放置4小时，4℃放置24小时，反复冻融3次均保持稳定。
　　结论：该方法具有良好的准确性、精密性和灵敏性，且操作快速、简便、稳定，各组分之间分离良好，适用于临床抗癫痫药物血药浓度的监测。
　　第二章：基因多态性对卡马西平药动学的影响。
　　目的：卡马西平(Carbamazepine，CBZ)是目前临床上最常用的抗癫痫药物之一，因其治疗窗窄、药物剂量和浓度的个体差异大，临床上需要对其进行治疗药物监测，并根据监测结果和疗效来调整药物的剂量。CBZ的主要作用靶点是钠离子通道，编码钠离子通道的基因具有多态性。CBZ是P450酶系CYP3A(Cytochrome P4503A，CYP3A)、微粒体环氧化物水解酶(microsomal epoxide hydrolase，mEH)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyhransferase，UGT)和多药抗药性相关蛋白2(multidrugresistance-associated protein2，MRP2，又称ABCC2)的底物。CYP3A、编码mEH、UGT和ABCC2的基因具有多态性，我们推测其多态性可能影响CBZ的体内过程，从而导致药动学上的差异。本研究的目的即是考察SCN1A/2A、CYP3A4/5、EPHX1、UGT2B7和ABCC2基因多态性对中国汉族癫痫患者卡马西平药动学的影响。
　　方法：收集166例CBZ单药治疗的中国汉族癫痫患者，使用CBZ维持剂量8周以上，血药浓度达稳态。在早上7点到9点服药之前采集外周静脉血2 ml，采用高分辨率熔解曲线法检测SCN1A c.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和IVS7-32A＞G、CYP3A4*1G、CYP3A5*3、ABCC23972C＞T和c.1249 G＞A、UGT2B7 c.802T＞C的基因分型，Taqman探针法检测SCN1A IVS5-91G＞A基因分型，测序法检测EPHX1 c.337T＞C的基因分型。CBZ的稳态血药浓度采用第一部分的HPLC方法进行测定。并以CBZ浓度/（日剂量/体重）为校正浓度CDRs(Concentration-Dose ratios)，CDR取自然对数后，成正态分布，采用单因素分析法(ANOVA)和多元线性回归法，考察基因多态性及性别、年龄、起病年龄、病程等临床混杂因素对癫痫患者维持剂量(Maintenance Dose)和校正浓度InCDRs的影响。
　　结果：⑴166例癫痫患者中，SCN基因4个突变位点SCN1A IVS5-91G＞A、SCN1Ac.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和SCN2A IVS7-32A＞G的变异频率分别为54.8％、12.4％、13.5％和11.7％。CYP3A4*1G、CYP3A5*3、EPHX1 c.337T＞C、UGT2B7 c.802T＞C的变异频率分别26.5％、70.5％、44.9％和64.8％。ABCC2基因2个突变位点3972C＞T和c.1249 G＞A的变异频率分别为16.9％和10.5％。连锁分析显示SCN1A的两个位点IVS5-91G＞A和c.3184A＞G，SCN2A的两个位点c.56G＞A和IVS7-32A＞G存在较高程度的连锁，D'值分别为0.79和0.99。CYP3A4*1G与CYP3A5*3存在较高程度的连锁，D'值为0.71。SCN1A/2A的4个位点构建得到频率大于3％的5种单倍体。⑵结果显示携带S CN1AIVS5-91 G＞A和EPHX1 c.337T＞C突变基因的患者需要较高的CBZ维持剂量(mg/kg/day)并且表现为较低水平的InCDRs，三种基因型间存在显著性差异。SCN1AIVS5 AA型和GA患者比GG型患者需要更高剂量的CBZ（10.35±3.27vs8.48±1.89，10.44±3.28 vs8.48±1.89，P＜0.05）。EPHX1 c.337 CT型患者比TT型的患者需要更高剂量的CBZ（9.65±3.04vs10.98±4.08，P＜0.05）。SCN1AIVS5-91 AA和GA型患者的CBZ lnCDRs(day/ml)比野生型纯合子GG型的患者显著降低（2.38±0.14 vs2.56±0.14，2.41±0.13 vs2.56±0.14，P＜0.001）。EPHX1 c.337CC型比TT型患者的CBZ lnCDRs显著降低（2.36±0.17 vs2.46±0.12，P＜0.05）。CT和TT型患者的CBZ lnCDRs未见明显差异。携带ABCC23972 T突变等位基因的患者比未携带此突变等位基因的患者需要更高剂量的CBZ维持剂量(mg/kg/day)，并存在显著性差异（9.89±3.08 vs10.80±3.35，p=0.047），但在ABCC23972C＞T的三种基因型间未见到维持剂量和血药浓度的差异。多因素分析的结果提示SCN1A IVS5-91G＞A和EPHX1 c.337T＞C与lnCDRs间存在显著性相关。未发现其余8个SNPs对CBZ患者维持剂量(Maintenance Dose)和校正浓度InCDRs的影响。
　　结论：研究提示SCN1A、EPHX1基因多态性是影响CBZ的维持剂量和lnCDRs的遗传因素，本研究为CBZ治疗方案优化和癫痫患者个体化给药提供了有价值的信息。
　　第三章：基因多态性对奥卡西平药动学的影响。
　　目的：奥卡西平(Oxcarbazepine，OXC)作为第二代抗癫痫药物，是卡马西平的一种10-酮类衍生物。尽管OXC的化学结构与CBZ相似，并有共同的作用靶点——钠离子通道。但两者在药代动力学、疗效和不良反应等方面均存在差异。OXC经胃肠道吸收后，在芳香基酮降解酶作用下代谢为其中间代谢产物羟基衍生物10，11-二氢-10-羟基卡马西平（monohydroxy carbamazepine，MHD）， MHD是OXC产生抗癫痫作用的主要化合物。OXC和MHD的主要清除途径是在葡萄糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronosyhransferase，UGT)的作用下，形成葡萄糖醛酸结合物随尿排出。此外， ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运体也参与OXC的体内过程，多药耐药相关蛋白2（multiple resistance-associated protein2，MRP2）又称ABCC2，是转运体亚家族之一。编码上述靶点、代谢酶和转运体的SCN1A/2A、UGT和ABCC2具有基因多态性。我们推测其多态性可能影响OXC的体内过程，从而导致药动学上的差异。本研究的目的是考察S CN1 A/2A、UGT2B7和ABCC2基因多态性对中国汉族癫痫患者OXC药动学的影响。
　　方法：收集OXC单药治疗的中国汉族癫痫患者，使用OXC维持剂量8周以上，血药浓度达稳态。在早上7点到9点服药之前采集外周静脉血2 ml，采用高分辨率熔解曲线法检测SCN1A c.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和IVS7-32A＞G、ABCC23972C＞T和c.1249 G＞A、UGT2B7 c.802T＞C的基因分型，Taqman探针法检测SCN1AIVS5-91G＞A基因分型。MHD稳态血药浓度采用第一部分的HPLC方法进行测定。并以MHD浓度/（日剂量/体重）为校正浓度CDR(Concentration-Dose ratios)，CDR取自然对数后，成正态分布，采用单因素分析法(ANOVA)和多元线性回归法，考察基因多态性及性别、年龄、起病年龄、病程等临床混杂因素对癫痫患者维持剂量(Maintenance Dose，mg/kg/day)和校正浓度InCDRs的影响。
　　结果：⑴MHD稳态血药浓度和维持剂量(Dose/Weight)的相关性分析稳态血药浓度和维持剂量(Dose/Weight)的相关系数r=0.583，p＜0.001，可以认为MHD稳态血药浓度和维持剂量成正相关。⑵184例癫痫患者中，SCN基因4个突变位点SCN1A IVS5-91G＞A、SCN1Ac.3184A＞G、SCN2Ac.56G＞A和SCN2AIVS7-32A＞G的变异频率分别为43.2％、9.2％、13.9％和10.9％。UGT2B7 c.802T＞C、ABCC23972C＞T和c.1249 G＞A的变异频率分别为66.0％、12.0％和10.5％。连锁分析显示SCN1AIVS5-91G＞A和c.3184A＞G，SCN2Ac.56G＞A和IVS7-32A＞G位点存在较高程度的连锁，D'值分别为0.95和0.99。SCN1A/2A的4个位点构建得到频率大于3％的7种单倍体。⑶携带SCN1AIVS5-91G＞A、UGT2B7 c.802T＞C、ABCC2 c.1249 G＞A突变基因的患者需要较高的OXC维持剂量(mg/kg/day)。SCN1AIVS5-91 AA型的患者比GG型和GA型患者需要更高剂量的OXC（16.95±6.56 vs14.54±4.74，p=0.007，14.42±5.18 vs16.95±6.56，P=0.046）。UGT2B7 c.802 CC型和CT型患者比TT型患者需要更高剂量的OXC(12.14±3.49 vs16.15±6.10,P=0.007;12.14±3.49 vs15.11±5.48,P=0.042)。ABCC2 c.1249 AA型和GA型患者比GG型患者需要更高剂量的OXC（14.63±5.25 vs25.66±10.17，P=0.006;14.63±5.25vs16.98±6.27，P=0.018）。SCN1AIVS5-91三种基因型患者OXC的lnCDR(day/ml)依次降低，GG＞GA＞AA，并存在显著性差异（2.90±0.29vs2.88±0.34 vs2.75±0.21，P＜0.05）。多因素分析的结果提示SCN1A IVS5-91G＞A影响校正浓度lnCDRs，不同基因间lnCDRs存在显著性相关。未发现其他SNPs对OXC维持剂量(Maintenance Dose)和校正浓度InCDRs的影响。
　　结论：研究提示SCN1A、UGT2B7、ABCC2基因多态性是影响OXC的维持剂量和lnCDRs的遗传因素，为OXC治疗方案优化和癫痫患者个体化给药提供了有价值的信息。
　　第四章：SCN1A/2A和ABCC2基因多态性在癫痫患者中的分布及其与癫痫耐药的相关性研究。
　　目的：研究发现尽管正规使用抗癫痫药物(antiepileptic drugs，AEDs)仍大约有三分之一的癫痫患者治疗失败，这种对AEDs产生耐受现象的特点是患者对多种抗癫痫药物产生多重耐药，其耐药原因和机制尚不完全清楚，以往的研究表明P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药抗药性相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRPs)的过度表达和药物作用靶点钠离子通道、GABA受体亚基改变是产生癫痫耐药的主要原因。ABCC2和SCN1A/2A是编码MRP2和钠离子通道的基因，具有多态性。本研究为探索中国汉族癫痫患者SCN1A/2A和ABCC2基因多态性及其单倍体与AEDs耐药的关系。
　　方法：收集中国汉族癫痫患者的临床资料，癫痫患者按照以下标准分为耐药组和药物反应组。耐药组(drug-resistant):正确选择和使用抗癫痫药物，以最大耐受量使用过两种以上的AEDs（包括单药和联合用药），一年内癫痫发作大于4次;药物反应组(drug-responsive):正确选择和使用抗癫痫药物，一年无发作，或至少经过三个发作周期无发作（无论发作周期的长短）。采静脉血2mL，提取DNA，采用高分辨率熔解曲线法检测 SCN1A c.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和IVS7-32A＞G、ABCC23972C＞T和c.1249 G＞A的基因分型，Taqman探针法检测SCN1AIVS5-91G＞A基因分型。应用基于最大似然(expectation maximization)算法的SHEsis软件进行单体型构建，采用Binarylogistic回归模型评估基因型及单体型与癫痫耐药发生风险的相关程度，并计算比数比(odd ratios，ORs)及95％可信区问(confidence interval, CI)。
　　结果：共计纳入453例癫痫患者（男性258例.女性195例），耐药组246例，药物反应组207例。SCN1A IVS5-91 G＞A的AA基因型与耐药显著相关，OR=3.41(1.73-6.70)，p＜0.001;等位基因A与耐药显著相关，OR=1.52(1.17-1.98)，p=0.002。ABCC2 c.1249G＞A的GA基因型与耐药显著相关，OR=2.14(1.23-3.71)，p=0.007，等位基因A与耐药显著相关，OR=2.05(1.31-3.19)，p=0.001。在两组中SCN1Ac.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A和IVS7-32A＞G和ABCC23972C＞T基因型未有显著性差异。在连锁不平衡分析中SCN1A IVS5-91G＞A和SCN1A c.3184A＞G之间存在连锁（D'值=0.899），SCN2Ac.56G＞A和SCN2A IVS7-32A＞G之间存在连锁(D'=0.991)。单倍体AAGA的频率(SCN1A IVS5-91G＞A/SCN1A c.3184A＞G/SCN2A c.56G＞A/SCN2A IVS7-32A＞G)在耐药组显著高于药物反应组(43.3％ vs34.3％，p=0.006)。单倍体AAGG的频率在耐药组显著高于药物反应组(8.2％ vs4.7％，p=0.036)。
　　结论：SCN1A IVS5-91G＞A和ABCC2 c.1249 G＞A基因多态性、单倍体AAGA和AAGG(SCN1A IVS5-91G＞A/SCN1A c.3184A＞G/SCN2A c.56G＞A/SCN2A IVS7-32A＞G)与抗癫痫药物耐药显著相关，并未发现SCN1A c.3184A＞G、SCN2A c.56G＞A、IVS7-32A＞G和ABCC23972C＞T基因多态性与耐药有显著相关性。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

第一章 HPLC法测定抗癫痫药物浓度的方法建立

1 引言

2 仪器和试药

3 实验方法

3．1 色谱条件

3．2 溶液及血浆样品的配制

3．3 血浆样品预处理

4 结果

4．1 色谱行为

4．2 线性范围

4．3 精密度

4．4 回收率试验

4．5 稳定性试验

4．6 干扰试验

4．7 患者血样测定

5 讨论

6 小结

7 附表

8 附图

第二章 基因多态性对卡马西平药动学的影响

1 引言

2 材料与方法

2．1 研究对象

2．2 CBZ血药浓度测定

2．3 基因分型

2．4 统计分析

3 结果

3．1 实验室结果

3．2 患者基本资料

3．3 基因型分布

3．4 单倍体分析

3．5 单位点分析

4 讨论

5 小结

6 附表

7 附图

第三章 基因多态性对奥卡西平稳态血药浓度的作用

1 引言

2 材料与方法

2．1 研究对象

2．2 MHD血药浓度测定

2．3 基因分型

2．4 统计分析

3 结果

3．1 患者基本资料

3．2 基因型分布

3．3 单倍体分析

3．4 单位点分析

4 讨论

5 小结

6 附表

7 附图

第四章 ABCC2、SCN1A／2A基因多态性与抗癫痫药物疗效的相关性研究

1 引言

2 材料与方法

2．1 研究对象

2．2 基因分型

2．3 统计分析

3 结果

3．1 患者基本资料

3．2 基因型分布

3．3 Binary logistic回归分析

3．4 SCN基因的连锁不平衡和单倍型分析

4 讨论

5 小结

6 附表

7 附图

总结与展望

参考文献

附录

攻读学位期间发表论文及申请课题

综述 抗癫痫药物相关基因多态性的研究进展

致谢